[發明專利]基于長DNA片段目標捕獲及MinION長讀數對HLA探針文庫進行測序的方法

有效

• 申請號: 202011068883.1
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112210597B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 姚斐
• 申請（專利權）人: 青島普澤麥迪生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6874
• 分類號: C12Q1/6874
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

1.基于長DNA片段目標捕獲及MinION長讀數對HLA探針文庫進行測序的非診斷目的的方法，其特征在于，包括以下步驟：

獲取樣本系的基因組DNA，對所得基因組DNA進行片段化，并對所得片段化的DNA進行末端修復；

將末端修復的DNA片段進行PCR擴增，其中，PCR擴增反應條件為：94℃、30秒，94℃、30秒，65℃、10分鐘，重復 10 個循環；65℃，10分鐘；

將得到的擴增的末端修復的片段化的DNA與HLA探針文庫進行雜交，獲得雜交混合物，其中，所述擴增的末端修復的片段化的DNA的片段大小為2.9kb-58.3 kb，平均大小為12.5kb；所述HLA探針文庫由不同的HLA基因制作而成，所述HLA基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1，其核苷酸序列依次為SEQID NO.1- SEQ ID NO.9所示；

利用磁珠捕獲所得雜交混合物中雜交的DNA片段，并洗滌去除未捕獲的DNA片段；

對磁珠捕獲的雜交的DNA片段進行PCR擴增，并對擴增產物進行純化，得到探針文庫的擴增產物，其中，PCR反應條件為：94℃、30秒，94℃、30秒，65℃、10分鐘，重復12-15個循環；65℃，10分鐘；

對所得到探針文庫的擴增產物進行末端修復并連接條碼，得到條碼-末端修復的探針文庫，其中所述條碼選自NB06或NB12，NB06的序列為SEQ ID NO.10所示，NB12的序列為SEQID NO.11所示；

將所得條碼-末端修復的探針文庫連接測序接頭，利用磁珠純化，得到純化后的連接測序接頭的條碼-末端修復DNA，檢測其回收量≥100ng時，利用MinlON納米孔測序儀進行DNA測序。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所得片段化的DNA長度為4 kb-33 kb，平均為9.85 kb。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對所得片段化的DNA進行末端修復具體為：

向PCR試管中依次添加50 μl的片段化的DNA、7 μl反應緩沖液、3 μl末端修復酶，共計60 μl，混勻并離心后，放入PCR儀中于20℃反應30 min、65℃反應30 min后，得到末端修復的片段化的DNA。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述末端修復的片段化的DNA的片段大小為4.9kb-31.9 kb，平均大小為12 kb。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將末端修復的DNA片段進行擴增具體為：

向試管中加入100 μl末端修復的片段化的DNA、200 μl多聚酶鏈反應混合液、40 μl多聚酶鏈反應引物，并用水將體積填補到400 μl，混勻離心后，通過PCR反應，然后純化，得到擴增的末端修復的片段化的DNA。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將得到的擴增的末端修復的片段化的DNA與HLA探針文庫進行雜交，獲得雜交混合物具體為：

向試管中加入6000 ng擴增的末端修復的片段化的DNA、5 μl 1 mg/ml的Cotl DNA和2μl的接頭封閉序列，于60℃下蒸干后，再加入8.5 μl 2 X雜交緩沖液、2.7 μl雜交緩沖液增強劑和1.8 μl水，震蕩混勻離心后將混合物轉移至95℃的PCR儀中孵育10分鐘，使其DNA變性；

取出變性后的DNA樣品，震蕩混勻后室溫下全速離心10秒，然后加入HLA探針文庫，震蕩混勻后再全速離心10秒，并將反應體系于熱蓋溫度為75℃的PCR儀上在65℃下雜交4h-24h。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對磁珠所捕獲的雜交的DNA片段進行PCR擴增具體為：

向磁珠捕獲的雜交的DNA片段中加入水，混合均勻后加入25 μl多聚酶鏈反應混合液和5 μl多聚酶鏈反應引物，通過PCR反應，得到探針文庫的擴增產物。