[發(fā)明專利]一種用于冷凍電鏡的免疫金標(biāo)記蛋白質(zhì)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011068573.X
• 申請(qǐng)日: 2020-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN111929436A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡栩源;陳若蟬;彭爭(zhēng)榮;祖映翔;吳峰靜;柏素芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N33/532;G01N23/2251;G01N23/2202
• 代理公司: 長(zhǎng)沙七源專利代理事務(wù)所(普通合伙) 43214
• 代理人: 劉伊?xí)D;周曉艷

本發(fā)明提供一種用于冷凍電鏡的免疫金標(biāo)記蛋白質(zhì)方法，包括如下步驟：1）利用多聚?L?賴氨酸溶液和PBS分別對(duì)冷凍電鏡的格柵進(jìn)行預(yù)處理；2）將格柵正面朝上放置在培養(yǎng)皿中，滴取樣品到格柵上，靜置孵育后用PBS洗脫；3）在培養(yǎng)皿中加入封閉劑，靜置孵育后用PBS洗脫；4）在培養(yǎng)皿中加入一抗，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體，靜置孵育后用PBS洗脫；5）在培養(yǎng)皿中加入二抗，即根據(jù)一抗種屬選取的免疫金抗體，靜置孵育后用PBS洗脫；6）取出格柵并用冷凍電鏡成像，分析圖像數(shù)據(jù)得到目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明結(jié)合免疫標(biāo)記蛋白質(zhì)技術(shù)和冷凍電鏡斷層掃描技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在冷凍電鏡成像中觀察到目標(biāo)蛋白質(zhì)的同時(shí)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種用于冷凍電鏡的免疫金標(biāo)記蛋白質(zhì)方法。

背景技術(shù)

免疫標(biāo)記蛋白質(zhì)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床及科學(xué)研究中，例如在室溫下對(duì)病理切片進(jìn)行分析等。該技術(shù)通過使蛋白質(zhì)抗體與蛋白質(zhì)孵育后特異性結(jié)合起到標(biāo)記蛋白質(zhì)的作用，但常規(guī)的免疫標(biāo)記方法只能用于實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的區(qū)分和示蹤，即證明樣品中含有該蛋白質(zhì)，而不可見蛋白質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)。

目前常采用的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的手段為冷凍電鏡斷層掃描技術(shù)，它是一種在低溫下使用透射電子顯微鏡來觀察樣品結(jié)構(gòu)的顯微技術(shù)，可通過獲取同一區(qū)域多個(gè)角度的投影圖來反向重構(gòu)研究對(duì)象的三維結(jié)構(gòu)，因此適合于在納米級(jí)尺度上研究不具有結(jié)構(gòu)均一性的蛋白、病毒、細(xì)胞器以及它們之間組成的復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。具體過程為：首先將樣品凍起來并保持低溫狀態(tài)放入顯微鏡內(nèi)，接著用高度相干的電子作為光源從樣品上方照射，電子透過樣品及附近的冰層時(shí)會(huì)發(fā)生散射，然后利用探測(cè)器和透鏡系統(tǒng)把散射信號(hào)成像記錄下來，最后對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理分析以得到目標(biāo)樣品結(jié)構(gòu)。但冷凍電鏡的缺點(diǎn)在于只能顯示蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)而不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

綜上所述，需要本領(lǐng)域技術(shù)人員開發(fā)一種新的免疫標(biāo)記蛋白質(zhì)技術(shù)，在鑒定蛋白質(zhì)的同時(shí)可對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種可在鑒定蛋白質(zhì)的同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的免疫標(biāo)記蛋白質(zhì)技術(shù)，以解決背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于冷凍電鏡的免疫金標(biāo)記蛋白質(zhì)方法，包括如下步驟：

步驟1）利用多聚-L-賴氨酸溶液和PBS（即磷酸緩沖鹽溶液）分別對(duì)冷凍電鏡的格柵進(jìn)行預(yù)處理；

步驟2）將格柵正面朝上放置在培養(yǎng)皿中，滴取樣品到格柵上，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟3）在培養(yǎng)皿中加入封閉劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行封閉，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟4）在培養(yǎng)皿中加入一抗，即目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟5）在培養(yǎng)皿中加入二抗，即根據(jù)一抗種屬選取的免疫金抗體，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟6）取出格柵并進(jìn)行冷凍處理，然后利用透射電子顯微鏡成像，最后對(duì)圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理以得到目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，在所述步驟2）~步驟5）中，裝有格柵的培養(yǎng)皿被放置在尺寸更大且裝有PBS的培養(yǎng)皿中，以確保培養(yǎng)皿周邊環(huán)境潮濕。

優(yōu)選地，在所述所述步驟2）~步驟5）中，所述PBS洗脫的具體過程為：用移液槍吸取PBS至格柵上，確保格柵的表面完全被PBS覆蓋，洗脫完成后用移液槍移去多余的液體。

優(yōu)選地，在所述步驟4）和步驟5）中，加入一抗和二抗的方式均為將抗體用PBS稀釋后加入培養(yǎng)皿中。

優(yōu)選地，在所述步驟2）中，所述培養(yǎng)皿中間設(shè)有用于容置格柵的凹槽結(jié)構(gòu)。所述凹槽結(jié)構(gòu)通常能容納2-3個(gè)格柵，確保在操作過程中格柵不會(huì)隨意移動(dòng)。