[發明專利]一種用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法

在審

• 申請號: 202011068573.X
• 申請日: 2020-10-09
• 公開（公告）號: CN111929436A
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 匡栩源;陳若蟬;彭爭榮;祖映翔;吳峰靜;柏素芬
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/532;G01N23/2251;G01N23/2202
• 代理公司: 長沙七源專利代理事務所(普通合伙) 43214
• 代理人: 劉伊旸;周曉艷

1.一種用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1）利用多聚-L-賴氨酸溶液和PBS分別對冷凍電鏡的格柵進行預處理；

步驟2）將格柵正面朝上放置在培養皿中，滴取樣品到格柵上，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟3）在培養皿中加入封閉劑對蛋白質進行封閉，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟4）在培養皿中加入一抗，即目標蛋白質的特異性抗體，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟5）在培養皿中加入二抗，即根據一抗種屬選取的免疫金抗體，靜置孵育后用PBS洗脫；

步驟6）取出格柵并進行冷凍處理，然后利用透射電子顯微鏡成像，最后對圖像數據進行分析處理以得到目標蛋白質的結構。

2.根據權利要求1所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，在所述步驟2）~步驟5）中，裝有格柵的培養皿被放置在尺寸更大且裝有PBS的培養皿中，以確保培養皿周邊環境潮濕。

3.根據權利要求2所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，在所述所述步驟2）~步驟5）中，所述PBS洗脫的具體過程為：用移液槍吸取PBS至格柵上，確保格柵的表面完全被PBS覆蓋，洗脫完成后用移液槍移去多余的液體。

4.根據權利要求3所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，在所述步驟4）和步驟5）中，加入一抗和二抗的方式均為將抗體用PBS稀釋后加入培養皿中。

5.根據權利要求4所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，在所述步驟2）中，所述培養皿中間設有用于容置格柵的凹槽結構。

6.根據權利要求1~5中任意一項所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，所述步驟1）中預處理格柵的具體過程為：首先用多聚-L-賴氨酸溶液覆蓋格柵，然后移除多聚-L-賴氨酸溶液，接著用1x PBS浸泡格柵，最后用鑷子將格柵夾取至濾紙上干燥備用。

7.根據權利要求6所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，所述多聚-L-賴氨酸溶液的質量濃度為0.01~0.1%。

8.根據權利要求7所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，在所述步驟1）之前，用純丙酮清洗格柵，并用輝光放電儀對格柵進行預處理。

9.根據權利要求8所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，在所述步驟6）中，采用Leica EMGP冷凍儀，冷凍格柵的具體過程為：用鑷子夾取格柵，設置冷凍儀使格柵的正面朝向冷凍儀的加樣側，用濾紙從加樣側的背面吸取格柵上多余的液體，樣品隨著液體擴散形成的液膜均勻分布并通過凍儀制冷形成薄冰層。

10.根據權利要求9所述用于冷凍電鏡的免疫金標記蛋白質方法，其特征在于，所述格柵為表面覆蓋連續碳膜的200目的銅網。