[發明專利]一種利用全細胞轉化制備覆盆子酮的方法

有效

• 申請號: 202011064833.6
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112126614B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 鄭璞;楊波;吳丹;陳鵬程
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/53;C12P7/26;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種利用全細胞轉化制備覆盆子酮的方法，屬于基因工程技術領域。本發明以共表達芐基丙酮還原酶和葡萄糖脫氫酶基因的重組工程菌作為生物催化劑，以對羥基亞芐基丙酮為底物，利用有透性的微生物全細胞自循環NADPH供體系統合成覆盆子酮，在50mL體系中，45℃下反應1小時，覆盆子酮濃度可高達9.4g·L^?1。本發明克服了化學合成高污染、非生物來源和生物發酵法低產量低、生產效率低等缺陷，提供了一種利用生物法高效合成覆盆子酮的方法。

技術領域

本發明涉及一種利用全細胞轉化制備覆盆子酮的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

覆盆子酮最早從覆盆子果中提取出來，是覆盆子果的主要香氣成分，具有特征性甜果香氣，天然覆盆子酮一般從植物中提取，如樹莓、黑莓、懸鉤子的果實中，產量較少且價格昂貴，每公斤約3000美元。市場上普遍使用的覆盆子酮是利用化石燃料對羥基苯甲醛和丙酮合成得到的。現如今在香料工業中，覆盆子酮已經成為一種具有極高經濟價值的香料，且僅次于香蘭素。覆盆子酮由于其特有的果香在食用香精、化妝品、誘蟲劑、醫藥等方面應用廣泛。覆盆子酮的乙酸酯(4-對乙酰氧基苯基-2-丁酮，CeuLure)被稱為誘蠅酮，是一種昆蟲引誘劑，對瓜蠅的檢測和防治起到了巨大作用(Florida Entomologist,1995)；覆盆子酮還被發現可以劑量依賴性的降低血糖，增加胰島素分泌，從而起到降糖的作用(LifeSciences,2005)。

目前的覆盆子酮的合成主要為化學合成和生物合成。

其中，覆盆子酮的化學合成路徑比較多，但生產上主要有3種：Albertus等人使用甲基乙烯基酮和苯酚為原料，強酸作為催化劑來合成覆盆子酮，再經萃取、蒸餾、重結晶等操作后得到覆盆子酮成品，收率約為69％，但該合成工藝中使用的原料甲基乙烯基酮的制備方法特別復雜，毒性較大，未能得到大范圍推廣；以苯酚和丁醇酮為原料，在酸催化下進行烷基化反應生成覆盆子酮，使用丁醇酮可以替代具有毒性甲基乙烯基酮，但反應過程中丁醇酮易失水生成甲基乙烯酮，并伴有其他的副產物的生成，而且此反應同樣要求在強酸和低溫條件下進行，也存在環境污染、設備腐蝕等問題；Claisen-Schmidt縮合法用對羥基苯甲醛和丙酮進行縮合之后加氫還原反應生成覆盆子酮，該方法收率高，產品質量好，但也會造成設備腐蝕、環境污染等問題。

而生物法合成覆盆子酮目前還處于實驗室階段；1998年Fuganti等人利用14種不同微生物將對羥基亞芐基丙酮還原，可檢測到覆盆子酮產生(Journal of MolecularCatalysis B Enzymatic,1998)；2007年Beekwilder等基于大腸桿菌中芐基丙酮還原酶的活性進一步引入來源于煙草的對香豆酸：CoA連接酶與來源于樹莓的查爾酮合成酶在大腸桿菌和酵母表達系統中進行表達，在大腸桿菌中覆盆子酮僅僅達到了5mg/L的產量(Biochemical Journal,2006)；2019年王程程等人于在大腸桿菌中過表達源于植物的編碼4-香豆酰輔酶A連接酶、芐基丙酮合酶、芐基丙酮還原酶3個基因，通過在發酵培養基中添加對香豆酸，僅僅只是獲得了178mg/L覆盆子酮的產量(Applied Microbiology andBiotechnology,2019)；可見，上述發酵法生產覆盆子酮的濃度普遍不高，并且發酵時間較長；多種異源蛋白的表達增加了大腸桿菌的代謝負擔，并且前體底物與代謝的中間產物均對細胞具有毒性，不利于菌體生長和前體底物轉化，也滿足不了生產要求。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種低成本、操作簡單且生產效率高的制備覆盆子酮的方法。