[發(fā)明專利]一種CD73人源化小鼠模型的構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011062364.4
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112251463B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設計）人: 琚存祥;王韜;楊笑柳;于薇薇
• 申請（專利權）人: 廣東藥康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;C12N15/55
• 代理公司: 北京天盾知識產(chǎn)權代理有限公司 11421
• 代理人: 孫倩倩

本發(fā)明公開了一種CD73人源化小鼠模型的構建方法，通過優(yōu)化該模型制備中所使用的打靶載體、sgRNA以及驗證步驟，高效成功的獲得了CD73人源化動物模型。本發(fā)明的模型在CD73靶向藥物與其他免疫檢查點或者小分子藥物聯(lián)合用藥的篩選應用中具有顯著優(yōu)勢。

技術領域

本發(fā)明涉及動物基因工程技術領域，具體為一種CD73人源化小鼠模型的構建方法。

背景技術

PD1、PDL1和CTLA4等在內的第一代免疫檢查點抑制劑，已成為腫瘤免疫治療的主力軍。盡管這些免疫檢查點在腫瘤免疫治療中取得不小成功，但是只有小部分病人對單一免疫檢查點表現(xiàn)出持久的響應，甚至有部分病人對目前已上市的檢查點抑制劑并不響應。對于如何克服實體腫瘤治療的耐藥性，其中很重要的方面就是對腫瘤微環(huán)境的調控，調控微環(huán)境中免疫抑制作用可顯著提高腫瘤免疫治療效果。

CD73是胞外-5’-核苷酸酶，通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于質膜的一種糖蛋白。CD73廣泛分布在人體組織細胞表面。CD73分子在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達，不僅參與嘌呤核苷酸的代謝和補救合成途徑，而且作為一種重要的免疫信號負調控分子，通過催化免疫抑制性介質腺苷(ADO)的形成，參與腫瘤的免疫逃逸。靶向CD73可能具有良好的抗腫瘤作用，而抗CD73與某些免疫分子調節(jié)劑聯(lián)合所顯示的增效作用也已成為近期研究熱點。因此抗CD73靶向治療有望成為一種新型聯(lián)合免疫療法。

人類疾病的發(fā)病機制研究，篩選有效的治療藥物，均需要進行大量臨床前試驗。由于直接利用人細胞及組織進行臨床前相關研究受到倫理方面的限制，動物模型就成為人類生物學研究的替代選擇。小鼠因體積小，易維持與操作，繁殖周期短,與人在基因組和生理學等特征方面相似，并且已經(jīng)有相應成熟的基因修飾技術，使其成為廣泛應用的哺乳動物模式生物系統(tǒng)。但由于小鼠生理特征與人存在較多差異，利用動物模型得到的實驗結果有時不能適用到人體上。然而利用基因修飾或細胞與組織移植的方法，將人類基因或細胞組織“放置”在小鼠模型上所制備的人源化小鼠模型，極大程度上模擬人類基因或細胞組織的相關活動，大大提高了這類小鼠模型作為模擬某些人類疾病的有效性。這就是我們通常所說的人源化小鼠模型，即帶有人類功能性基因、人類細胞或組織的小鼠模型。

CD73人源化小鼠是指利用基因修飾的方法，在免疫系統(tǒng)健全的小鼠上，將鼠源的CD73基因替換為人源的基因，構建能與抗人源CD73單抗相互作用小鼠模型，為臨床前抗人源CD73單抗篩選提供更實惠且易取的動物評價體系。我們構建了針對mouse?CD73基因的gRNA和攜帶human?CD73基因片段的載體，利用CRISPR/Cas9技術和胚胎注射技術，使用人源CD73基因替換鼠源CD73。同時，我們對于CRISPR/Cas9技術中用到的各個原件包括gRNA等進行了充分的優(yōu)化和調整，保證采用該技術制備人源化CD73基因動物模型的成功率和準確率。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種CD73人源化小鼠模型的構建方法，該模型具備在CD73靶向藥物與其他免疫檢查點或者小分子藥物聯(lián)合用藥的高效篩選應用的優(yōu)點，解決了人類疾病的發(fā)病機制研究，篩選有效的治療藥物，均需要進行大量臨床前試驗,且由于直接利用人細胞及組織進行臨床前相關研究會受到倫理方面的限制的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

提供一種CD73人源化小鼠模型的構建方法，其特征在于，將人CD73編碼氨基酸序列插入鼠CD73基因5’UTR后面，末端加入一段終止序列3×ployA，使得小鼠CD73蛋白無法表達，人源CD73蛋白受小鼠CD73基因的啟動子及5’UTR調控，包括以下步驟：(1)構建表達人源化CD73的表達載體用于人源化CD73基因的插入，具體采用SLIC方式將多個片段連接在一起構建打靶載體；(2)確定用于模型制備的sgRNA序列；(3)將表達人源化CD73的表達載體和sgRNA連同Cas9蛋白注射到受精卵，移植至假孕小鼠，其中人源化CD73基因的序列如SEQ?IDNO：2所示。