[發明專利]一種CD73人源化小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 202011062364.4
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112251463B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 琚存祥;王韜;楊笑柳;于薇薇
• 申請（專利權）人: 廣東藥康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;C12N15/55
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 孫倩倩

1.一種CD73人源化小鼠模型的構建方法，其特征在于，將人CD73編碼氨基酸序列插入鼠CD73基因5’UTR后面，末端加入一段終止序列3×ployA，使得小鼠CD73蛋白無法表達，人源CD73蛋白受小鼠CD73基因的啟動子及5’UTR調控，包括以下步驟：（1）構建表達人源化CD73的表達載體用于人源化CD73基因的插入，具體采用sLIC方式將多個片段連接在一起構建打靶載體；（2）確定用于模型制備的sgRNA序列：針對目的片段選取的脫靶率最低的sgRNA，序列如SEQ?ID?NO：3所示；（3）將表達人源化CD73的表達載體和sgRNA連同Cas9蛋白注射到受精卵，移植至假孕小鼠，其中人源化CD73基因的序列如SEQ?ID?NO：2所示，

其中打靶載體上包含CD73-5arm、CD73-3arm、huCD73-CDS及3xployA，

擴增CD73-5arm序列的引物如下：

HUCD73-5ARMF:?tgcaccggtttaattaacaccgctgagggtcccaaag

HUCD73-5ARMR:?ggggacacatggctggctagagcgcgttga；

擴增huCD73-CDS序列的引物如下：

HUCD73-CDSF:

ctagccagccatgtgtccccgagccgcgcgggcgcccgcgacgctactcctcgccc

HUCD73-CDSR:

Tattcatcgcgctattggtataaaacaaagatcactgcccaaagtg；

擴增3xployA序列的引物如下：

STOPF:?taccaatagcgcgatgaataaatgaaagcttgc

STOPR:?gccgcgggacgggttccggatcagcttgatg；

擴增CD73-3arm序列的引物如下：

HUCD73-3ARMF:?tccggaacccgtcccgcggccgctaaggtacccaag

HUCD73-3ARMR:?ggaccggtttaattaaagaggtggaggagactgggatg；

還包括對假孕生的仔鼠進行基因型鑒定，篩選成功插入正確人源片段的陽性鼠F0小鼠，F0與B6背景鼠配繁獲得F1，對F1代鼠尾進行基因鑒定。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：其中步驟（1）中打靶片段載體制備步驟如下：

1）通過NOTI+SPEI酶切pl253-DTA質粒獲得線性化的pl253-DTA；

2）使用C57BL/6基因組PCR擴增CD73-5arm、CD73-3arm，獲得huCD73-CDS片段，及連接在CDS片段之后的3xployA序列，回收備用；

3）將CD73-5arm、CD73-3arm、線性化的pl253-DTA、huCD73-CDS和3xployA進行SLIC連接，使用PCR鑒定載體完整性；

4）終載體構建成功后，使用PACI/AGEI酶切回收3839bp的條帶，完成測序，用于注射。

3.根據權利要求1所述的方法，其中鑒定基因型所使用的引物如下：

擴增5’arm序列的引物如下：

mCD73-5tF1：tagctgtcaggtttacccgctag

hCD73-5tR1：ataactgggcactcgacacttg；

擴增3’arm序列的引物如下：

hCD73-3tF1：ttggaggcacatttgacctagtc

mCD73-3tR1：tcattgtgctcggacttcagag；

擴增WT序列的引物如下：

mCD73-wt-tF1：tcctctactccgcagtttagtagag

mCD73-wt-tR1：acgtcgtttgtgtgcaggatc。

4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：還包括對CD73蛋白表達的檢測、免疫系統驗證和CD73抑制劑抗腫瘤藥效驗證。