[發(fā)明專利]一種豬血清樣中病原抗體ELISA檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011062115.5
• 申請(qǐng)日: 2020-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN112285347A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 武春燕;南雨辰;周恩民;鄭旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N27/62;C07K14/08
• 代理公司: 北京智為時(shí)代知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

本發(fā)明涉及一種通過使用特異性抗體捕獲豬源抗原加工提呈細(xì)胞APCs上負(fù)責(zé)加工提呈抗原的豬白細(xì)胞抗原II類DR分子（SLA?DR），將SLA?DR上提呈的抗原肽以三氟乙酸洗脫后，脫鹽處理重懸后進(jìn)行質(zhì)譜分析以測(cè)定抗原肽氨基酸序列，鑒定出豬特定病原所有編碼的蛋白中可被機(jī)體抗原提呈細(xì)胞所加工提呈的抗原肽序列，并通過基因工程的方法將以上方法獲得的CD4⁺T表位抗原肽分別與NanoLuc熒光素酶融合后使用大腸桿菌進(jìn)行體外重組表達(dá)并純化，作為一種人工抗原與相應(yīng)病原感染的豬血清樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，以尋找可被病原感染的豬血清樣本識(shí)別的CD4⁺T表位抗原肽序列，進(jìn)一步將所有抗體ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的抗原肽序列串聯(lián)后在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，作為人工抗原用于給定病原的特異性抗體檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬血清樣中病原抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，特別涉及分離和鑒定PRRSV抗原肽及其應(yīng)用，特別是用于豬血清樣中病原抗體ELISA檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

宿主機(jī)體的免疫系統(tǒng)在對(duì)外源性的病原感染，抗原刺激或疫苗（以下統(tǒng)稱為外源性免疫原）免疫的過程做出反應(yīng)的過程中，主要通過宿主免疫系統(tǒng)中的抗原提呈細(xì)胞（APCs）對(duì)外源性的抗原進(jìn)行捕獲，并進(jìn)行加工提呈，將完整的外源性免疫原蛋白降解切割為長(zhǎng)度為12-24的氨基酸長(zhǎng)度的抗原肽片段，以上的抗原肽片段可以裝配與主要組織相容性復(fù)合物（MHC）II類分子的抗原肽結(jié)合槽中，形成“MHC-II-抗原肽”復(fù)合物。在豬體內(nèi)，負(fù)責(zé)完成此過程的MHC-II類分子為豬白細(xì)胞抗原-II DR（Swine leukocyte antigen DR，SLA-DR）并表達(dá)于多種APCs表面，如豬肺泡巨噬細(xì)胞，或淋巴組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。豬APCs表面的SLA-DR分子所加工提呈的抗原肽，能夠作為豬特異性CD4⁺T細(xì)胞表位，被豬體內(nèi)相應(yīng)的CD4⁺T細(xì)胞所識(shí)別，最終激活豬機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶，保護(hù)機(jī)體免受病原的感染。

因此在豬免疫系統(tǒng)活化的過程中，最終引發(fā)免疫應(yīng)答的有效抗原成分僅僅是外源性免疫原被APCs加工提呈后長(zhǎng)度為12-24個(gè)氨基酸的抗原肽片段（即豬特異性CD4+ T表位），而并非完整的免疫原。因此，直接使用來源于免疫原的CD4⁺T表位片段刺激機(jī)體即可激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生與使用完整外源性蛋白抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)類似的免疫應(yīng)答。此外，使用來源于完整外源性免疫原的一個(gè)或多個(gè)CD4⁺T表位片段通過全人工合成或是基因工程重組表達(dá)的方法可以表達(dá)為一種僅含有CD4⁺T表位的重組蛋白，所獲得的重組蛋白可以作為一種基因工程疫苗用于豬傳染病的預(yù)防。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）引起的以母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸障礙為主要特征的病毒性傳染病，并能引起嚴(yán)重的免疫抑制。該病毒已在全球豬群中廣泛傳播，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為全球規(guī)模化豬場(chǎng)的主要疫病之一，也是全球豬病控制上的一大難題。市場(chǎng)上現(xiàn)有的PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，主要以PRRSV病毒的主要核衣殼蛋白N為包板抗原進(jìn)行檢測(cè)，存在因?yàn)椴《究乖儺愃鶎?dǎo)致的漏檢現(xiàn)象。