[發明專利]一種豬血清樣中病原抗體ELISA檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202011062115.5
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112285347A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 武春燕;南雨辰;周恩民;鄭旭
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N27/62;C07K14/08
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

1.一種豬血清樣中病原抗體ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括豬病原特異性抗原肽，所述抗原肽是利用豬源APCs在豬種屬上對病原或外源性蛋白進行特異性抗原肽(即CD4+T表位)篩選鑒定的方法得到，所述方法包括如下步驟：

步驟一，豬源APCs細胞的制備；

步驟二，抗原肽的質譜鑒定；

步驟三，基于NanoLuc融合蛋白的抗原肽的ELISA驗證。

2.根據權利要求1所述的ELISA檢測試劑盒，所述豬源APCs細胞的制備采用如下方法：（1）豬骨髓源樹突狀細胞，通過分離仔豬的長腿骨，開孔后使用細胞培養液沖洗骨髓腔，獲得的骨髓細胞經過豬粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子（GM-CSF）的誘導后經體外培養7天后獲得；（2）豬肺泡巨噬細胞，通過沖洗豬肺臟后，將肺泡灌洗液離心后獲得；（3）豬外周血單核細胞源巨噬細胞，收集豬抗凝血，通過使用淋巴細胞分離液，從抗凝血中獲得豬外周血單核細胞，加入豬粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子（GM-CSF）和豬白介素4（IL-4）體外誘導培養7天后獲得；或者（4）使用外來免疫原免疫豬個體，其后，分離豬的脾臟，淋巴結，經過體外在單細胞濾網上研磨獲得包含有豬內源性巨噬細胞的免疫細胞群。

3.根據權利要求1所述的ELISA檢測試劑盒，所述的抗原肽的質譜鑒定的方法包括如下步驟：（1）制備富集“SLA-DR-抗原肽”復合物；（2）獲得抗原肽氨基酸序列；（3）使用質譜儀測定抗原肽的分子量，并通過質譜分析軟件搜索病原來源蛋白氨基酸數據庫的方式以確定抗原肽氨基酸序列。

4.根據權利要求1所述的ELISA檢測試劑盒，所述制備富集“SLA-DR-抗原肽”復合物的方法為：使用APCs經過免疫原刺激（如病毒感染，加入抗原和APCs共培養等方式），再使用細胞裂解緩沖液裂解APCs制備細胞裂解液，使用識別SLA-DR的抗體從全細胞裂解液中富集“SLA-DR-抗原肽”復合物。

5.根據權利要求1所述的ELISA檢測試劑盒，所述獲得抗原肽氨基酸片段的方法為：將富集“SLA-DR-抗原肽”復合物使用三氟乙酸緩沖液處理，從SLA-DR上分離洗脫抗原肽，再使用截留分子量為5kD的超濾管，去除殘留抗體及SLA-DR分子單體，使濾過液中僅含有抗原肽，再通過脫鹽處理后，即得到所述抗原肽氨基酸片段。

6.根據權利要求1所述的ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒為豬血清樣中PRRSV病原抗體ELISA檢測試劑盒，所述豬病原特異性抗原肽為PRRSV抗原肽。