[發明專利]一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011061975.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112195222A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 董宏圖;張晗;羅斌;王成;王曉冬;李愛學
• 申請（專利權）人: 北京農業信息技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明涉及一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法。柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，包括：提供系列已知濃度的柑橘黃龍病病菌DNA；對所述DNA進行瓊脂糖凝膠電泳；對所得電泳條帶進行分析，得到對應的條帶亮度值；構建所述DNA的濃度與所對應的條帶亮度值的標準曲線；提供待測樣品的DNA和柑橘黃龍病病菌的特異性擴增引物，進行PCR擴增；對所述PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對所得電泳條帶進行分析，得到待測樣品的條帶亮度值；根據所述標準曲線獲得待測樣品的DNA濃度。本發明檢測方法可以實現對未知病菌濃度的植物組織中病菌含量定量檢測，結果準確，操作方便。

技術領域

本發明涉及一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法。

背景技術

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘(包括橘、柑、橙、柚、枳等)生產上危害最嚴重和最具破壞性的毀滅性病害。黃龍病被認為是由一種專生于柑橘韌皮部組織的細菌引起。其傳播途徑包括嫁接和柑橘木虱傳播。目前所有已知的柑橘品種及柑橘近緣種都受到黃龍病病菌的浸染。感病后的植株不僅不能產生經濟價值，且易感程度高的品種如臍橙、葡萄柚等會在幾年內逐漸衰亡，尚無黃龍病治療康復的相關報道。因此對于黃龍病病菌的快速、準確和定量檢測，對于黃龍病的防控和研究具有重要的意義。

目前針對柑橘黃龍病病菌檢測方法主要包括田間診斷、血清學診斷等，隨著分子生物學檢測方法廣為流行，最常用的是基于普通PCR技術的檢測方法，這種方法操作簡單快捷，可以準確的鑒定出植株是否攜帶黃龍病病菌，但僅限于進行定性檢測，不能對植株體內含菌量進行定量評估。因此如何對柑橘屬植物體內黃龍病病菌含量進行評估，對于田間及實驗室研究具有重要作用。

發明內容

本發明實施例提供一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，可以實現對未知病菌濃度的植物組織中病菌含量定量檢測，結果準確，操作方便。

本文所述的柑橘黃龍病病菌是指韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter spp.)。

本發明實施例提供一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，包括：

提供系列已知濃度的柑橘黃龍病病菌DNA；

對所述DNA進行瓊脂糖凝膠電泳；

對所得電泳條帶進行分析，得到對應的條帶亮度值；

構建所述DNA的濃度與所對應的條帶亮度值的標準曲線；

提供待測樣品的DNA和柑橘黃龍病病菌的特異性擴增引物，進行PCR擴增；對所述PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對所得電泳條帶進行分析，得到待測樣品的條帶亮度值；根據所述標準曲線獲得待測樣品的DNA濃度。

在一些實施例中，所述系列已知濃度的柑橘黃龍病病菌DNA可以通過熒光定量PCR擴增獲得。

在一些實施例中，經試劑盒純化的柑橘黃龍病病菌DNA的濃度可以通過儀器nanodrop2.0測得。

在一些實施例中，可以利用image J軟件對瓊脂糖凝膠電泳的電泳條帶進行分析，得到條帶亮度值。

在一些實施例中，所用的特異性擴增引物為：