[發明專利]一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法

在審

• 申請號: 202011061975.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112195222A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 董宏圖;張晗;羅斌;王成;王曉冬;李愛學
• 申請（專利權）人: 北京農業信息技術研究中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

1.一種柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，包括：

提供系列已知濃度的柑橘黃龍病病菌DNA；

對所述DNA進行瓊脂糖凝膠電泳；

對所得電泳條帶進行分析，得到對應的條帶亮度值；

構建所述DNA的濃度與所對應的條帶亮度值的標準曲線；

提供待測樣品的DNA和柑橘黃龍病病菌的特異性擴增引物，進行PCR擴增；對所述PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對所得電泳條帶進行分析，得到待測樣品的條帶亮度值；根據所述標準曲線獲得待測樣品的DNA濃度。

2.根據權利要求1所述柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，其中，所述柑橘黃龍病病菌為韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter spp.)。

3.根據權利要求1或2所述柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，其中，所用的特異性擴增引物為：

Hlbsf 5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGA

Hlbsr 5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT。

4.根據權利要求1-3任一項所述柑橘黃龍病病菌快速定量檢測方法，包括：

1)取感染柑橘黃龍病的植物葉片，磨碎，用試劑盒進行DNA提取，得到DNA樣品；

以已提取的DNA為擴增模板，采用上述特異性擴增引物Hlbsf/Hlbsr，進行PCR擴增反應；

擴增反應結束后，取PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對目標條帶進行回收純化；

對膠回收產物進行DNA濃度測量，將擴增產物配制成濃度分別為1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl工作液；分別以濃度1ng/μl、10ng/μl和100ng/μl的DNA為模板，采用上述特異性擴增引物Hlbsf/Hlbsr，進行PCR擴增；

PCR擴增結束后，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統得到擴增結果，利用image J軟件對擴增條帶進行分析，得到每個條帶亮度對應的數值，以模板濃度為橫坐標、亮度值為縱坐標，構建標準曲線；

2)另取待測樣品的柑橘黃龍病菌DNA，按照上述程序進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、擴增條帶亮度分析，獲得條帶亮度值，根據所述標準曲線獲得待測樣品的DNA濃度。

5.用于柑橘黃龍病病菌快速檢測的引物，所述引物為：

Hlbsf 5'→3'TGTAAAGCTCTTTCGCCGGA

Hlbsr 5'→3'CTTGACGTCATCCCCACCTT。