[發明專利]表達豬δ冠狀病毒S1基因的重組腺病毒和制備方法

在審

• 申請號: 202011061204.8
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112143713A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 趙攀登;呂玉金;張曉戰;井匯源;吳玉臣
• 申請（專利權）人: 河南牧業經濟學院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州知己知識產權代理有限公司 41132
• 代理人: 季發軍

本發明公開了表達豬δ冠狀病毒S1基因的重組腺病毒及其制備方法，所述重組腺病毒包含豬δ冠狀病毒S1基因，所述重組腺病毒感染AD293細胞后能夠穩定表達豬δ冠狀病毒S1蛋白，制備步驟為：獲取豬δ冠狀病毒的總RNA；反轉錄S1基因并進行鑒定；獲取S1基因的cDNA模板；設計引物，擴增S1基因并純化回收；構建pDC315/S1重組質粒；擴增S14獲得的pDC315/S1重組質粒；將S15獲得的pDC315/S1重組質粒進行病毒包裝，獲得含有pDC315/S1重組質粒的重組腺病毒，包裝成功了重組腺病毒，該重組腺病毒感染AD293細胞后能夠大量準確的表達S1蛋白，為疫苗的制備奠定基礎。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其是涉及表達豬δ冠狀病毒S1基因的重組腺病毒和制備方法。

背景技術

豬δ冠狀病毒(Porcineδcoronavirus,PDCoV)是一種新興冠狀病毒,可引發仔豬的嘔吐、腹瀉、脫水,甚至死亡,給養豬業造成巨大損失。PDCo V主要編碼的4個結構蛋白是:纖突蛋白(Spike,S1)、核衣殼蛋(nucleocapsid,N)、膜糖蛋白(membrane,M)、小膜蛋白(envelope,E)，其中，纖突蛋白由S1基因編碼，因此纖突蛋白也被稱為S1蛋白，S1蛋白具有受體結合位點，并決定病毒的嗜性，能夠誘導豬產生中和抗體進行免疫保護的結構蛋白，因此，攜帶S1基因的重組腺病毒可以用于制作疫苗，激活豬的體液免疫和細胞免疫，針對豬δ冠狀病毒的防控具有很大的優勢，然而，目前并沒有關于攜帶豬δ冠狀病毒S1基因的腺病毒的相關研究。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是針對現有技術的不足，提供表達豬δ冠狀病毒S1基因的重組腺病毒和制備方法，包裝成功了重組腺病毒，該重組腺病毒感染AD293細胞后能夠大量準確的表達S1蛋白，為疫苗的制備奠定基礎。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

表達豬δ冠狀病毒S1基因的重組腺病毒，所述重組腺病毒包含豬δ冠狀病毒S1基因，所述重組腺病毒感染AD293細胞后能夠穩定表達豬δ冠狀病毒S1蛋白。

進一步的，所述豬δ冠狀病毒S1基因的序列如S1EQ ID NO.1所示，所述豬δ冠狀病毒S1蛋白的序列如S1EQ ID NO.2所示.

進一步的，包括以下步驟：

S1、獲取豬δ冠狀病毒的總RNA；

S2、反轉錄S1基因并進行鑒定；

S3、獲取S1基因的cDNA模板；

S4、設計引物，擴增S1基因并純化回收；

S4、構建pDC315/S1重組質粒；

S5、擴增S4獲得的pDC315/S1重組質粒；

S6、將S5獲得的pDC315/S1重組質粒進行病毒包裝，獲得含有pDC315/S1重組質粒的重組腺病毒。

進一步的，步驟S11中，鑒定含有轉錄S1基因的RNA的步驟包括：

1)設計鑒定引物，所述鑒定引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物為PDCoV-S1-pF1，參見S1EQ ID NO.3，所述下游引物為PDCoV-S1-pR1，參見S1EQ ID NO.4；

2)反轉錄并擴增總RNA；

3)跑膠，觀測目的條帶。

進一步的，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物為PDCoV-S1-F，參見SEQ ID NO.5，所述下游引物為PDCoV-S1-R，參見SEQ ID NO.6。

進一步的，還包括：