[發明專利]一種L-薄荷醇產量提高的重組酵母菌

有效

• 申請號: 202011060996.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112175849B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;于文文;馬駿;房峻
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/88;C12N9/02;C12N9/04;C12N9/90;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/61;C12P7/02;C12R1/865
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明公開了一種L?薄荷醇產量提高的重組酵母菌，屬于代謝工程技術領域。本發明以酵母菌為出發菌株，采用誘導型啟動子表達基因ERG20WW或/和NPPS，重構MVA代謝合成途徑，使得化合物IPP與DMAPP更趨向于合成化合物GPP與NPP，進而更利于L?薄荷醇的代謝合成。采用誘導型啟動子過表達基因L3H，提高L3H酶的表達量，促進檸檬烯轉化為反式異胡椒醇，或通過蛋白酶融合表達tLIS與L3H基因，克服因L3H酶活過低而導致L?薄荷醇發酵產量低的因素。采用YPD液體培養基發酵4d，發酵至對數生長期后期添加10％的半乳糖水溶液誘導EEG20WW、NPPS基因與L?薄荷醇代謝途徑基因的表達，保證了細胞的正常生長繁殖，L?薄荷醇的發酵產量最高達到30.14mg/L。

技術領域

本發明涉及一種L-薄荷醇產量提高的重組酵母菌，屬于代謝工程技術領域。

背景技術

L-薄荷醇(L-menthol)是具有高揮發性單環單萜物質，白色針狀結晶，易溶于石油醚、氯仿等有機溶劑，微溶于水。L-薄荷醇是世界范圍內銷量最大的香料之一，全球年需求量超過2萬噸。L-薄荷醇因為具有清涼、殺菌、止癢、鎮痛等作用，被廣泛的應用于食品、日化、醫藥、煙草等領域；且還可以作為前體物質合成其他香味物質。目前L-薄荷醇的工業化生產方式較為單一，主要為天然提取與化學合成，天然提取方法需要大量的薄荷屬植物原料，化學合成L-薄荷醇同樣需要植物來源的百里酚等化合物為底物進行反應拆分。但植物原料生長周期長，市場反饋慢，且容易受到氣候、地域等自然環境因素的影響出現產量不穩定。另有以長葉薄荷酮等為底物進行全細胞或酶催化制備L-薄荷醇的方法，仍無法解決植物原料的限制因素。

申請人在前期構建了一株重組釀酒酵母工程菌WMT4，首次實現了發酵法生產L-薄荷醇，利用廉價的發酵培養基培養4d左右，L-薄荷醇的發酵產量達到5.03mg/L，但是仍然存在L-薄荷醇發酵產量低的缺點。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種L-薄荷醇產量提高的重組酵母菌，采用誘導型啟動子表達基因ERG20WW與NPPS，重構MVA代謝合成途徑，使得化合物IPP與DMAPP更趨向于合成化合物GPP與NPP，進而更利于L-薄荷醇的代謝合成。采用誘導型啟動子過表達基因L3H，提高L3H酶的表達量，促進檸檬烯轉化為反式異胡椒醇，通過蛋白酶融合表達tLIS與L3H基因，克服因L3H酶活過低而導致L-薄荷醇發酵產量低的因素。

本發明的第一個目的是提供一種L-薄荷醇產量提高的重組酵母菌，所述的重組酵母菌是以產L-薄荷醇的基因工程菌為出發菌株，表達了法尼基焦磷酸合酶突變體基因ERG20WW和/或橙花二磷酸合酶基因NPPS，所述的產L-薄荷醇的基因工程菌是以酵母菌為宿主，過表達內源MVA合成途徑中的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因IDI和截短的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因tHMG1，并異源表達截短的檸檬烯合成酶基因LIS、檸檬烯羥基化酶基因L3H、細胞色素P450還原酶基因CPR、反式異胡椒醇脫氫酶基因IPDH、異薄荷二烯酮還原酶基因IPR、類固醇異構酶基因KSI、長葉薄荷酮還原酶基因PGR和薄荷醇還原酶基因MMR。

進一步地，所述的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的NCBI編號是NP_015208.1，所述的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的NCBI編號是NP_013636.1，檸檬烯合成酶的NCBI編號是AAC37366.1，檸檬烯羥基化酶的NCBI編號是AAD44151.1，細胞色素P450還原酶的NCBI編號是ABB88839.2，反式異胡椒醇脫氫酶的NCBI編號是AAU20370.1，異薄荷二烯酮還原酶的NCBI編號是AAQ75422.1，類固醇異構酶的NCBI編號是AFY18860.1，長葉薄荷酮還原酶的NCBI編號是AAQ75423.1，薄荷醇還原酶的NCBI編號是AAQ55960.1。

進一步地，所述的法尼基焦磷酸合酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的橙花二磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。