[發(fā)明專利]一種解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中抗菌脂肽的分離方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011060014.4
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112079899B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田露;王旭陽;劉榮杰;龔國利
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西科技大學(xué)
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/34
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發(fā)明公開了一種解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中抗菌脂肽的分離方法，將解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液離心，使所得發(fā)酵清液起泡后收集并冷卻泡沫，然后將由泡沫生成的無泡清液經(jīng)酸沉、抽提、濃縮、干燥，得到脂肽成品，本發(fā)明通過在發(fā)酵液粗分離工藝中引入起泡操作，使發(fā)酵產(chǎn)生的大部分脂肽通過附著在泡沫上而簡便、快速的富集。本發(fā)明的分離工藝簡單，并且脂肽收率高、純度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵液中抗菌脂肽的粗分離，具體涉及一種簡便、有效且低成本的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液處理方法。

背景技術(shù)

目前食品工業(yè)所使用的化學(xué)防腐劑，例如，苯甲酸、山梨醇等，影響了人類的健康，對自然環(huán)境也產(chǎn)生了污染。同時抗生素的廣泛、大量使用，造成抗生素對致病菌的抑制作用明顯降低。隨著致病菌抗藥能力的增強(qiáng)，需要開發(fā)新的抗菌物質(zhì)。脂肽化合物主要表現(xiàn)出的特性包括抗菌、抗血凝、抗病毒、抗腫瘤、抗支原體、抗原蟲以及較強(qiáng)的表面活性，且耐pH、耐熱、臨界膠束濃度較低、能螯合金屬離子、易降解、不易產(chǎn)生耐藥性等。

由Arima等首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)能夠產(chǎn)生抗菌脂肽Surfactin，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefacierss)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagularss)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、蘇云金芽胞桿菌(B.lhurirsgierssis)、地衣芽孢桿菌(B.lzchemformis)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulars)和類芽孢桿菌(P.aersibacillus)等都能產(chǎn)生脂肽類化合物。雖然產(chǎn)生抗菌脂肽的菌株很多，但目前已報導(dǎo)的抗菌脂肽的產(chǎn)量還難以達(dá)到商品化生產(chǎn)的要求，抗菌脂肽提取和精制過程中分離純化的生產(chǎn)成本占發(fā)酵總成本的60％以上，所以限制了抗菌脂肽工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)及應(yīng)用。

抗菌脂肽的提取方法受發(fā)酵方式、理化性質(zhì)和脂肽種類的不同而有所差異。同時，分離純化在整個發(fā)酵生產(chǎn)的過程中起到保證質(zhì)量、決定其經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵作用。目前通常采用的抗菌脂肽分離方法包括沉淀法和有機(jī)溶劑萃取法。其中，沉淀法主要包括酸沉、鹽析和有機(jī)溶劑沉淀等，但是沉淀法得到的抗菌脂肽產(chǎn)品純度較低、雜質(zhì)多，不符合工業(yè)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。而有機(jī)溶劑萃取法使用例如氯仿等對抗菌脂肽進(jìn)行抽提，使提取的產(chǎn)品中不可避免的殘留有毒的溶劑，存在一定的安全隱患，同時造成抗菌脂肽的生物活性降低。

結(jié)合抗菌脂肽結(jié)構(gòu)特性，及不同的分離方法的利弊，目前一般都采用將兩種或兩種以上的相關(guān)分離純化技術(shù)組合應(yīng)用于抗菌脂肽的提取中，從而達(dá)到提高產(chǎn)量、降低成本的目的。例如，中國專利CN107964557A公開了一種提高芽孢桿菌抗菌脂肽產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其抗菌脂肽分離方法為：離心、發(fā)酵上清進(jìn)行酸沉淀(鹽酸、pH2.0、4℃過夜)后再離心，收集沉淀；沉淀物冷凍干燥后利用甲醇浸提，對甲醇浸提物減壓濃縮獲得抗菌脂肽粗提物；其還在發(fā)酵過程中添加少量的脂肪酸，以提高脂肽的產(chǎn)量。但其抗菌脂肽分離工藝實際涉及反復(fù)浸提和濃縮，不僅操作繁瑣、耗時，而且所得脂肽提取物的純度、得率并不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液中抗菌脂肽的分離方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種從菌體發(fā)酵液中分離抗菌脂肽的方法，包括以下步驟：

1)去除發(fā)酵液中的菌體，得到發(fā)酵清液；

2)使發(fā)酵清液在加熱和/或機(jī)械作用下產(chǎn)生泡沫，并將產(chǎn)生的泡沫分離，待分離的泡沫冷卻，得到由泡沫生成的無泡清液；

3)調(diào)節(jié)無泡清液的pH值為酸性后靜置；然后分離生成的沉淀物；

4)將沉淀物用醇類溶劑進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行過濾(去除不溶的雜質(zhì))，得到濾液；

5)將濾液濃縮后干燥，得到黃棕色粉末狀抗菌脂肽成品。

優(yōu)選的，所述步驟1)具體包括以下步驟：通過離心分離發(fā)酵液中的菌體后收集上清液。