[發明專利]一種測定血清中乙酰膽堿酯酶含量的方法

在審

• 申請號: 202011057222.9
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112213421A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 全東琴;王永安;張亞丹;申遼;王濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/74
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 崔婧;劉海羅

1.一種測定血清中乙酰膽堿酯酶含量的方法，包括如下步驟：

(1)將血清與乙酰膽堿或其鹽在28℃～45℃于反應介質中反應5～120分鐘，終止反應，然后固液分離，收集液相物；其中，血清與乙酰膽堿或其鹽的比例為1:(2～35)L/mmol；

(2)采用液相色譜分別檢測液相物和空白樣品中的乙酰膽堿，分別得到第一峰面積和第二峰面積；其中，液相色譜的色譜柱為C18色譜柱；液相色譜的流動相：水相為含2～20mM正庚烷磺酸鈉和0.05％(v/v)～0.5％(v/v)三氟醋酸的水溶液，有機相為乙腈；以步驟(1)中反應介質等體積地替代步驟(1)中血清，其余與步驟(1)中相同，收集的液相物為所述空白樣品；

(3)根據第二峰面積與第一峰面積之差通過外標分析法計算得到血清中乙酰膽堿酯酶含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(3)中，所述外標分析法利用標準曲線進行計算，其中，所述標準曲線通過如下的步驟建立：

1)將系列濃度的乙酰膽堿酯酶溶液分別與乙酰膽堿或其鹽在28℃～45℃于反應介質中反應5～120分鐘，終止反應，然后固液分離，收集到多個液相物；其中，乙酰膽堿酯酶和乙酰膽堿或其鹽的比例為(5～110):1U/mmol；

2)采用液相色譜分別檢測液相物和對照樣品中的乙酰膽堿，分別得到第三峰面積和第四峰面積；其中，液相色譜采用的色譜柱及流動相與步驟(2)中相同；以步驟1)中反應介質等體積地替代步驟1)中乙酰膽堿酯酶溶液，其余與步驟1)中相同，收集的液相物為所述對照樣品；

3)根據第四峰面積與第三峰面積之差以及液相物中的乙酰膽堿酯酶含量得到標準曲線；其中，

液相物中的乙酰膽堿酯酶含量＝乙酰膽堿酯酶溶液的體積×乙酰膽堿酯酶溶液中的乙酰膽堿酯酶濃度/液相物的體積。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(2)和/或步驟2)中，液相色譜的條件包括如下A至I中的一項或多項：

A.液相色譜為高效液相色譜；

B.色譜柱規格為250×4.6mm；

C.柱溫為28℃～35℃；

D.洗脫程序：水相和有機相以(7～10):1體積比等度洗脫；

E.流動相流速為1～3ml/min；

F.進樣量為10～25μl；

G.采用紫外檢測器；

H.檢測波長為200～220nm；

I.乙酰膽堿出峰時間為5.7～5.8分鐘。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(1)和/或步驟1)中，通過加入終止劑來終止反應。

5.根據權利要求4所述的方法，其中，終止劑包含體積比為(20～55):(25～70):(0.05～5)的甲醇、乙腈和三氟醋酸。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(1)和/或步驟1)中，反應介質為磷酸緩沖鹽溶液。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(1)和/或步驟1)中，通過離心處理進行固液分離；

優選地，離心處理的轉速為5000～12000g；

優選地，離心處理的時間為2～20分鐘。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其中，步驟(1)中，在反應前，將血清稀釋，優選稀釋2～70倍；

優選地，采用磷酸緩沖鹽溶液稀釋。

9.根據權利要求2所述的方法，其中，步驟1)中，乙酰膽堿酯酶溶液以牛血清白蛋白溶液為溶劑；

優選地，牛血清白蛋白溶液的濃度為1～5mg/ml。

10.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于如下a至f中的一項或多項：

a.步驟(1)和/或步驟1)中，乙酰膽堿鹽為氯化乙酰膽堿；

b.步驟(1)和/或步驟1)中，乙酰膽堿或其鹽溶解于反應介質中，所得溶液中乙酰膽堿或其鹽的濃度為2～35mM；

c.步驟(1)中，乙酰膽堿或其鹽溶解于反應介質所得溶液的體積等于血清體積；

d.步驟1)中，乙酰膽堿或其鹽溶解于反應介質所得溶液的體積等于乙酰膽堿酯酶溶液的體積；

e.步驟(1)和/或步驟1)中，所述反應在水浴鍋中進行；

f.步驟(1)中，血清為哺乳動物血清，優選為大鼠血清。