[發明專利]脂肪組織的凍存與復蘇方法及脂肪組織凍存復蘇試劑盒

在審

• 申請號: 202011055473.3
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112155008A
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 趙成;安文強;董白翔;張錦旭
• 申請（專利權）人: 北京銀豐鼎誠生物工程技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 山東舜天律師事務所 37226
• 代理人: 李新海

本發明公開了一種脂肪組織的凍存方法：(1)脂肪組織的預處理；(2)加入脂肪組織凍存一階段試劑，離心洗滌；加入脂肪組織凍存二階段試劑，進行程序降溫。本發明還公開了一種凍存的脂肪組織的復蘇方法：從液氮中取出凍存的脂肪組織，融化，加入脂肪組織復蘇液，離心洗滌，完成復蘇。本發明還公開了一種脂肪組織的凍存復蘇試劑盒，包括上述的脂肪組織凍存一階段試劑，脂肪組織凍存二階段試劑，脂肪組織復蘇液。利用本發明的凍存方法凍存的脂肪組織可保持長時間細胞活性，復蘇后提取的脂肪干細胞能表達多種干細胞標志物，可向脂肪、骨、軟骨細胞進行分化，具有非常好的穩定性，極大的提升了脂肪組織的利用率。

技術領域

本發明涉及一種脂肪組織的凍存與復蘇方法及脂肪組織凍存復蘇試劑盒，屬于細胞生物學領域。

背景技術

自體脂肪移植技術在整形外科領域應用廣泛，作為一種理想的移植填充物，脂肪具有來源豐富、取材方便、成本低、無免疫排斥現象等優點，但脂肪移植后存在高吸收率的問題，因此僅進行一次填充手術并不能達到滿意的術后效果。雖然近年來眾多臨床醫生和科研人員針對脂肪組織的獲取過程、洗滌純化方法、注射手法等各方面都進行了研究和改良，但移植后的脂肪留存率仍不盡如人意，保持在50％左右的水平。臨床使用時需多次抽脂取材和注射填充才能達到預期效果。反復的手術抽脂不僅降低了醫生的工作效率，還給患者帶來痛苦并且提高并發癥發生率。一次獲取大量脂肪冷凍保存以備多次治療，這在節約時間精力成本和減少臨床并發癥方面具有很大的優勢。

脂肪間充質干細胞(adipose stem cells，ADSCs)逐漸成為近年來干細胞儲存的重要內容和組織工程及再生醫學的研究熱點，具有極大的應用潛能，大量研究證實：ADSCs能夠增殖分化形成缺少損傷的細胞，分化結果證實其可被誘導分化成多種細胞，包括脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肝細胞和神經細胞等。

有研究證明，利用脂肪組織中提取的脂肪間充質干細胞和脂肪組織混合移植的方式可以有效的提高脂肪組織的成活率，達到更好的整形效果。為避免多次手術抽脂取材、實現“一次獲取，多次治療”的目的，探索一種體外長期保存自體脂肪組織的方法顯得尤為重要。

深低溫凍存是儲存人體組織、細胞最常用方法，且可利用凍存的脂肪組織提取脂肪間充質干細胞，此方法具有取材容易、不用二次取材、儲備量大、體外可大規模培養等優點。

目前脂肪組織的低溫保存方法未形成統一的標準化方案，提取的脂肪組織不進行處理單純進行凍存會出現脂肪組織壞死、提取的間充質干細胞數量不足、活性不強的缺點，且凍存脂肪的生物學活性和臨床應用的安全性一直未得到證實，如何將大量獲取的脂肪組織進行保存且保持細胞活性是目前迫切需要解決的實際問題。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種脂肪組織的凍存方法、復蘇方法，提供了一種脂肪組織凍存液、復蘇液，提供了一種脂肪組織凍存、復蘇試劑盒。本發明建立了完善的樣本采集規范，建立了標準的脂肪組織凍存工藝，同時建立了細胞復蘇培養工藝，形成了一套完整的脂肪組織凍存復蘇試劑盒，利用該試劑盒處理的脂肪組織經超低溫冷凍可長期保存，脂肪組織復蘇后提取的脂肪間充質干細胞可保持干細胞相關特性。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種脂肪組織的凍存方法，包括以下步驟：

(1)脂肪組織的預處理：取采集的脂肪標本，離心去掉上層油脂，下層水層，保留中層脂肪組織，中層脂肪組織用生理鹽水洗滌1～3次，得到洗滌后的脂肪組織；

(2)向上述脂肪組織中加入脂肪組織凍存一階段試劑，離心洗滌；離心后去除洗滌液，向剩余的脂肪組織中加入脂肪組織凍存二階段試劑，混勻，4℃下預冷15min，然后轉移至程序降溫儀中進行程序降溫；程序降溫結束后，將凍存的脂肪細胞轉移至-196℃的液氮存儲罐中存儲；

所述程序降溫程序為：

4℃保持5min，5℃/min降溫到0℃；