[發明專利]脂肪組織的凍存與復蘇方法及脂肪組織凍存復蘇試劑盒

在審

• 申請號: 202011055473.3
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112155008A
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 趙成;安文強;董白翔;張錦旭
• 申請（專利權）人: 北京銀豐鼎誠生物工程技術有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 山東舜天律師事務所 37226
• 代理人: 李新海

1.一種脂肪組織的凍存方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)脂肪組織的預處理：取采集的脂肪標本，離心去掉上層油脂，下層水層，保留中層脂肪組織，中層脂肪組織用生理鹽水洗滌1～3次，得到洗滌后的脂肪組織；

(2)向上述脂肪組織中加入脂肪組織凍存一階段試劑，離心洗滌；離心后去除洗滌液，向剩余的脂肪組織中加入脂肪組織凍存二階段試劑，混勻，4℃下預冷15min，然后轉移至程序降溫儀中進行程序降溫；程序降溫結束后，將凍存的脂肪細胞轉移至-196℃的液氮存儲罐中存儲；

所述脂肪組織凍存一階段試劑，是由以下組分組成的，各組分按重量百分比計：DMEM培養基75％～80％，二甲基亞砜5％～15％，海藻糖5％～8％；

所述脂肪組織凍存二階段試劑，是由以下組分組成的，各組分按重量百分比計：DMEM培養基75％～80％，二甲基亞砜5％～15％，海藻糖3％～8％，丙二醇2％～4％，谷胱甘肽0.5％～1％，丙酮酸鈉0.08％～0.12％。

2.根據權利要求1所述的脂肪組織的凍存方法，其特征在于：所述程序降溫的程序為：

4℃保持5min，5℃/min降溫到0℃；

0℃保持5min，2℃/min降溫到-15℃；

-15℃保持5min，1℃/min降溫到-65℃；

-65℃保持5min，0.5℃/min降溫到-80℃。

3.根據權利要求1所述的脂肪組織的凍存方法，其特征在于：所述步驟(1)的具體操作方式為：取采集的脂肪標本，分裝轉移至50ml離心管中，離心；吸掉上層油脂，將中層脂肪組織轉移至新的離心管中，加入等體積的生理鹽水，離心，棄掉上清；重復生理鹽水洗滌脂肪組織兩次。

4.根據權利要求1所述的脂肪組織的凍存方法，其特征在于：所述步驟(2)的具體操作方式為：向上述脂肪組織中加入等體積的脂肪組織凍存一階段試劑，離心洗滌；離心后去除洗滌液，剩余的脂肪組織用玻璃棒進行攪勻，分裝到5ml凍存管中，每管2.5ml，加入脂肪組織凍存二階段試劑，放入漩渦振蕩器混勻，轉移至4℃冰箱內預冷15min，然后轉移至程序降溫儀中進行程序降溫。

5.一種凍存的脂肪組織的復蘇方法，其特征在于：從液氮中取出凍存的脂肪組織或利用權利要求1～4中任一項所述的凍存方法凍存的脂肪組織，融化；向融化后的液體中加入脂肪組織復蘇液，離心洗滌；離心后去除洗滌液，得脂肪沉淀，完成復蘇，脂肪沉淀可進行原代培養；

所述脂肪組織復蘇液，是由以下組分組成的，各組分按重量百分比計：DMEM培養基75％～85％，右旋糖苷15～25％，L-谷氨酰胺1％～2％，D-葡萄糖1％～2％。

6.根據權利要求5所述的凍存的脂肪組織的復蘇方法，其特征在于：所述脂肪組織復蘇液，是由以下組分組成的，各組分按重量百分比計：DMEM培養基78％，右旋糖苷19％，L-谷氨酰胺1.5％，D-葡萄糖1.5％。

7.根據權利要求5所述的凍存的脂肪組織的復蘇方法，其特征在于：進行原代培養的方法為：向脂肪沉淀中加入消化液和Ⅰ型膠原酶溶液，充分混勻封口后放入37℃搖床，150轉/min，消化1小時；消化后，離心，棄掉上層脂肪，用DMEM/F12培養基重懸細胞沉淀，離心；棄掉上清，用DMEM/F12培養基重懸細胞沉淀，用100μm的篩網過濾得脂肪細胞，離心，棄上清，將脂肪細胞用完全培養基重懸，接種至培養瓶中，保證接種細胞濃度為2.5×10⁴cells/ml，放入37℃、CO₂培養箱中進行培養，24小時后細胞換液，去除未貼壁細胞；以后每三天換液一次。