[發(fā)明專利]一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011055284.6
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112063652A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張立華;任宏偉
• 申請（專利權(quán)）人: 棗莊學(xué)院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/65;A01H4/00;A01H5/10;A01H6/00
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 楊陽

一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法及其應(yīng)用，本發(fā)明在石榴幼果時期，向石榴幼果的子房內(nèi)注射農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌通過與石榴胚珠的充分接觸，從而有效地將外源基因?qū)胧裼着呒?xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)育成種子，經(jīng)篩選檢測獲得石榴轉(zhuǎn)基因植株。該方案成本低，可以有效地解決石榴轉(zhuǎn)基因育種困難的問題。該發(fā)明直接侵染石榴的幼胚，轉(zhuǎn)化后的幼胚在果實內(nèi)發(fā)育成種子，每個石榴子房內(nèi)胚珠數(shù)量大約在200粒左右，即使轉(zhuǎn)化效率不高，所獲得的轉(zhuǎn)化植株的數(shù)量也是十分可觀的；獲得的陽性植株就是F1代，縮短了育種的周期。

技術(shù)領(lǐng)域

本方法屬于基因工程育種領(lǐng)域，通過使用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入野生型石榴并成功表達(dá)外源基因相關(guān)性狀，具體涉及一種石榴子房注射的轉(zhuǎn)基因方法。

背景技術(shù)

石榴(Punica granatum)為石榴科石榴屬植物，全世界的溫帶和熱帶都有種植。Lansky等人研究發(fā)現(xiàn)石榴的葉、花、果、根等部分，都具有特殊的藥理作用。近年來，石榴的栽培及開發(fā)利用受到關(guān)注。目前石榴育種方法仍然以傳統(tǒng)的雜交育種為主，效率低速度慢，難以滿足需求。如何通過基因工程手段改變石榴的園藝性狀或?qū)κ裰械拇紊x相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，培育人們所需要的石榴品種，從而進(jìn)一步培育出高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良的石榴新品種是當(dāng)前需要解決的問題。

目前國內(nèi)外用于植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、微注射法、電穿孔法、微束激光打孔法等方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法因操作簡便、成本較低，最為常用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化又分為離體愈傷組織侵染和活體直接侵染，其中離體愈傷組織侵染最為常用，活體直接侵染較為少見，有報道小型草本植物擬南芥的花序直接浸入農(nóng)桿菌溶液中，因擬南芥的花器官特別小，子房壁細(xì)胞層數(shù)極少，農(nóng)桿菌可侵入珠心進(jìn)入受精卵或胚細(xì)胞，從而可以獲得轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥種子，但該方法不適于花器官較大的植物。石榴的轉(zhuǎn)基因育種多為離體組織根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)，通過使用根癌農(nóng)桿菌將外源基因?qū)胧裼鷤M織中，隨后對陽性愈傷組織進(jìn)行抗性篩選，最終通過植物激素誘導(dǎo)愈傷組織成苗，從而獲得陽性植株。但是該方法成本較高，難度較大，獲得的石榴轉(zhuǎn)基因苗陽性率低，況且該方案在國內(nèi)并不成熟。石榴作為一種木本植物，目前沒有在石榴植株活體上直接遺傳轉(zhuǎn)化的報道。

子房是被子植物花器官的重要組成部分，位于花的雌蕊下面，一般略為膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以發(fā)育為種子。 是被子植物花中雌蕊的主要組成部分，子房由子房壁和胚珠組成。當(dāng)傳粉受精后，子房發(fā)育成果實。子房壁最終發(fā)育成果皮。

本發(fā)明在石榴幼果時期，向石榴幼果的子房內(nèi)注射農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌通過與石榴胚珠的充分接觸，從而有效地將外源基因?qū)胧裼着呒?xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步發(fā)育成種子，經(jīng)篩選檢測獲得石榴轉(zhuǎn)基因植株。該方案成本低，可以有效地解決石榴轉(zhuǎn)基因育種困難的問題。

該發(fā)明直接侵染石榴的幼胚，轉(zhuǎn)化后的幼胚在果實內(nèi)發(fā)育成種子，每個石榴子房內(nèi)胚珠數(shù)量大約在200粒左右，即使轉(zhuǎn)化效率不高，所獲得的轉(zhuǎn)化植株的數(shù)量也是十分可觀的；獲得的陽性植株就是F1代，縮短了育種的周期。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對目前缺乏有效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的石榴轉(zhuǎn)化體系，本發(fā)明通過石榴幼果子房注射的方法，建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的石榴轉(zhuǎn)化體系，為石榴轉(zhuǎn)基因育種建立新的方法，為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是步驟如下：

步驟（1）制備農(nóng)桿菌注射液：無菌操作，將處于對數(shù)生長期并攜帶有目的基因與抗性基因表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行離心收集菌體，將菌體沉淀加入侵染液中，從而獲得含有菌體的侵染液；