[發(fā)明專利]一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進行轉(zhuǎn)基因的方法及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011055284.6 | 申請日： | 2020-09-29 |
| 公開（公告）號： | CN112063652A | 公開（公告）日： | 2020-12-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張立華;任宏偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 棗莊學院 |
| 主分類號： | C12N15/84 | 分類號： | C12N15/84;C12N15/65;A01H4/00;A01H5/10;A01H6/00 |
| 代理公司： | 濟南泉城專利商標事務(wù)所 37218 | 代理人： | 楊陽 |
| 地址： | 277100 *** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 通過 桿菌 注射 技術(shù) 石榴 果子 胚珠 進行 轉(zhuǎn)基因 方法 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進行轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是步驟如下：
步驟（1）制備農(nóng)桿菌注射液：無菌操作，將處于對數(shù)生長期并攜帶有目的基因與抗性基因表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌液進行離心收集菌體，將菌體沉淀加入侵染液中，從而獲得含有菌體的侵染液；
步驟（2）注射侵染液：石榴植株上選擇子房略微膨大的健康石榴幼果作為實驗材料，使用尖頭鑷去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球?qū)Υ迫锘車慕M織進行充分消毒，使用無菌針灸針在雌蕊基部位置緩慢垂直扎入石榴幼果子房部位，隨即取出，切記不可扎傷石榴胎座組織，使用無菌微量注射器在針眼部位淺層處垂直緩慢注入通過（1）制備的根癌農(nóng)桿菌侵染液，注射體積為50-150 μL，注射完畢取下注射器，使用酒精棉球再次輕微擦拭傷口，給整個幼果套上紙袋；
步驟（3）轉(zhuǎn)化效果抽樣檢測：隨機抽取已注射侵染液72小時的石榴幼果，解剖幼果取出胚珠進行GUS染色，觀察根癌農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化效果；
步驟（4）陽性石榴苗的篩選：待石榴果實完全成熟后，收獲健康的石榴種子，經(jīng)過除菌種植在抗生素抗性的MS固體培養(yǎng)基中，對陽性苗進行篩選，培養(yǎng)溫度為28~30℃，光照時間為18h.d-1，光照強度為2000lx，培養(yǎng)30天后獲得石榴幼苗，對不同株石榴幼苗進行分子鑒定，從而篩選獲得陽性植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進行轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是所使用的載體為攜帶β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）與卡那霉素抗性基因的PBI121載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進行轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是所述的石榴品種為大青皮石榴和大紅袍石榴。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過農(nóng)桿菌注射技術(shù)對石榴幼果子房內(nèi)胚珠進行轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是所述的農(nóng)桿菌為
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