[發明專利]一種環瓜氨酸肽雙微球偶聯物及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202011055170.1
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112495319B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 石懷興;溫志國
• 申請（專利權）人: 海豐生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: B01J13/14
• 分類號: B01J13/14;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/546;G01N33/543
• 代理公司: 北京華清迪源知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 彭伶俐

本發明公開了一種環瓜氨酸肽雙微球偶聯物及其制備方法與應用，所述方法包括將羧基膠乳微球和氨基微球與環瓜氨酸肽連接，形成氨基微球?環瓜氨酸肽?羧基微球偶聯物。本發明利用兩個粒徑接近的微球，先使用羧基微球，再使用氨基微球與CPP抗原進行偶聯，以提升檢測試劑的靈敏度，同時，可以保持較好的檢測線性范圍；本發明方法制備的試劑具有較好的穩定性，且試劑的制備工藝簡單。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種環瓜氨酸肽雙微球偶聯物及其制備方法與應用。

背景技術

RA是最常見的關節炎癥性疾病，發達國家成人的發病率是1～2％，病因不明，可發生在任何年齡，但常見35-55歲女性發病，RA屬于慢性疾病，以階段性發著與緩解交替為特征。

抗-CCP抗體被發現可用于類風濕關節炎的早期診斷，并對RA病人的關節侵害和放射學損傷具有一定的預測價值。抗CCP抗體可以在RA病人出現明顯的關節損傷之前被檢測出。一項前瞻性群組研究顯示，在沒有出現明顯的RA臨床癥狀的抗CCP陽性的病人中，約有93％的病人會發展成RA，表明該抗體有非常好的陽性預期值。

目前，測定抗環瓜氨酸肽(CCP)抗體常用的方法有免疫層析法、ELISA法、化學發光法、膠乳免疫比濁法等。其中，免疫層析法檢測速度快，但其準確度和重復性不佳；ELISA法操作繁瑣，檢測時間長；化學發光法檢測的準確度和重復性好，但耗時而且價格昂貴，對設備的要求較高；膠乳免疫比濁法操作簡單、使用方便，但現有的免疫比濁法檢測試劑盒存在靈敏度和穩定性較差，線性范圍比較窄的缺點。為提高靈敏度和線性，現多采用大粒徑微球和小粒徑微球混合的方法，但大微球的生產工藝比較難控制，其試劑穩定性也難于優化。也有采用增加CCP在微球的偶聯量來實現靈敏度的提升，但由于空間位阻的影響，能夠發揮作用的CCP的量是有限的，即使CCP的偶聯量增加，但在微球表面的有效標記量未必有明顯的改變甚至是更少了。

綜上所述，現有檢測方法中，其通過采用大粒徑微球或者額外制備輔助偶聯物提高靈敏度和線性。其存在著制備工藝繁瑣、制備效率低、制造成本高的缺陷。

發明內容

為此，本發明提供一種環瓜氨酸肽雙微球偶聯物及其制備方法與應用。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種環瓜氨酸肽雙微球偶聯物的制備方法，所述方法包括將羧基膠乳微球和氨基微球與環瓜氨酸肽連接，形成氨基微球-環瓜氨酸肽-羧基微球偶聯物。

本發明的一個實施例中，所述羧基微球與所述環瓜氨酸肽連接過程為：將活化后的羧基微球與0.05M?MOPS緩沖液稀釋的環瓜氨酸肽溶液混合均勻，室溫攪拌0.5h，得到羧基微球與環瓜氨酸肽偶聯物；其中，所述羧基微球為聚苯乙烯膠乳微球。

本發明的一個實施例中，所述聚苯乙烯膠乳微球的活化方法為：在20mL0.05M?MES緩沖液中加入1mL直徑為120nm的10％聚苯乙烯膠乳微球，再加入5mL濃度為1mg/mL碳化二亞胺水溶液，室溫攪拌30min，得到活化后的聚苯乙烯膠乳微球。

本發明的一個實施例中，所述羧基微球與環瓜氨酸肽偶聯物加入到氨基微球溶液中均勻混合，攪拌，得到含氨基微球-環瓜氨酸肽-羧基微球偶聯物的溶液。

本發明的一個實施例中，所述氨基微球溶液是將0.5mL?10％的氨基膠乳微球加入到10mL?0.01％的BSA溶液混合形成。

本發明的一個實施例中，所述方法還包括：向所述含氨基微球-環瓜氨酸肽-羧基微球偶聯物的溶液中加入2mL?5％BSA攪拌1h，進行封閉，得到含穩定的氨基微球-環瓜氨酸肽-羧基微球偶聯物的溶液。

本發明的一個實施例中，將所述含穩定的氨基微球-環瓜氨酸肽-羧基微球偶聯物的溶液用pH8.0的MOPS緩沖液洗滌，離心，棄去上清，得到氨基微球-環瓜氨酸肽-羧基微球偶聯物。