[發明專利]一種分枝桿菌檢測鑒定的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202011048938.2
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112280840A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 呂江峰;任緒義;潘彩霞;楊燚超
• 申請（專利權）人: 杭州迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/04;G16B25/20;G16B30/10;G16B50/00;C12R1/32
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

本發明涉及臨床微生物檢測領域，提供了一種快速檢測并鑒定臨床樣本中分枝桿菌的試劑盒及方法。該試劑盒包含2條通用引物擴增分枝桿菌16S rRNA的可變區序列，1條特異引物屏蔽羅氏菌屬細菌16S rRNA的可變區，1條特異引物屏蔽棒狀桿菌屬細菌的16SrRNA的可變區，1條測序引物測定所擴增的分枝桿菌特異性片段正向區段的序列，親和素標記的磁珠，測序結果與數據庫比對判斷種屬。應用此試劑盒能檢測并鑒定臨床樣本中分枝桿菌，可用于各類臨床樣本中疑似分枝桿菌感染的臨床診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方便，特異性強的優點。

技術領域

本發明屬臨床微生物檢測鑒定技術領域，具體涉及一種分枝桿菌檢測鑒定的試劑盒及其檢測方法。

背景技術

分枝桿菌屬包括結核分枝桿菌復合群(MTB、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌等)，麻風分枝桿菌以及非結核分枝桿菌(Non-Tuberculosis Mycobacterium(NTM)。MTB引起的結核病是一種慢性的人獸共患性傳染病。根據世界衛生組織的統計，目前全球感染MTB的人口已經超過1/3，每年約有200萬人死于結核病。目前NTM包含169種和13個亞種，廣泛分布于不同的環境中，從水、土壤、空氣、食物、原生動物、植物、動物和人類均有分離得到。作為條件致病菌的分枝桿菌，一般很少引起疾病，但是在一定條件下如支氣管擴張、慢性阻塞性肺炎、免疫抑制等病人中會對人體造成嚴重的傷害。目前已經發現的致病性NTM有100種之多，并呈逐年上升趨勢。NTM肺病往往對一線二線抗結核藥耐受，常規藥物治療效果欠佳，因此建立快速、有效的NTM檢測方法對于提高NTM肺病的診斷及治療具有重要意義。目前用于結核病診斷的方法有很多,例如使用最廣泛的涂片鏡檢，但其靈敏度較低，尤其是對于肺外結核病,以及HIV病毒合并感染的NTM病，其檢測效率更低。分子生物學的發展很大程度上促進了結核病的診斷與藥物敏感性分析。熒光定量PCR技術是一種高效的分子生物學技術，廣泛應用于醫學、微生物學、食品學、動植物學等各個領域。該技術對于MTB的檢測同樣具有重要意義，已成功用于對包括肺、淋巴結、皮膚、胸腹膜、肝、腎等類型組織中MTB檢測，且陽性率遠高于傳統的抗酸染色法。但熒光定量PCR法需要設計針對特定菌種的特異性引物和探針，只能檢測的特定的菌種，檢測靶標有限，一定程度上限制了其應用范圍。Pyrosequencing(焦磷酸測序)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便，特別是在短片段DNA的測序分析上具有快速、準確的特點，因此廣受研究者青睞，并在很多方面已應用于臨床微生物的分型鑒定及耐藥檢測。本研究建立了一種快速檢測并鑒定臨床痰液、肺泡灌洗液、胸腹水等標本中結核以及非結核分枝桿菌的方法---PCR-焦磷酸測序法，該方法利用分枝桿菌屬在16S rDNA的相對保守性，通過在保守區設計通用引物對分枝桿菌進行PCR擴增，然后利用測序引物對PCR產物中的可變區進行焦磷酸測序，測序結果與數據庫序列進行比對，從而到達對分枝桿菌進行檢測和種屬鑒定的目的。采用該體系進行臨床標本的分枝桿菌快速檢測鑒定從得到標本到出鑒定結果只需要4h，一次可以同時鑒定96個標本。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可靠準確的檢測并鑒定臨床樣本中分枝桿菌的試劑盒。

本發明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒的檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種分枝桿菌檢測鑒定的試劑盒，其特征在于，它包括：

(1)擴增分枝桿菌16S rRNA可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物對；

(2)屏蔽羅氏菌屬細菌16S rRNA可變區的特異引物：其核苷酸序列如SEQID NO：3所示引物對；

(3)屏蔽棒狀桿菌屬細菌16S rRNA可變區的特異引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示引物對；