[發明專利]一種分枝桿菌檢測鑒定的試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202011048938.2
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112280840A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 呂江峰;任緒義;潘彩霞;楊燚超
• 申請（專利權）人: 杭州迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/04;G16B25/20;G16B30/10;G16B50/00;C12R1/32
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

1.一種分枝桿菌檢測鑒定的試劑盒，其特征在于，它包括：

(1)擴增分枝桿菌16S rRNA可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示引物對；

(2)屏蔽羅氏菌屬細菌16S rRNA可變區的特異引物：其核苷酸序列如SEQID NO：3所示引物對；

(3)屏蔽棒狀桿菌屬細菌16S rRNA可變區的特異引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示引物對；

(4)測序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

(5)親和素標記的磁珠；

其中，SEQ ID NO：2在其5’端標記生物素；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4在其3’端標記MGB；

上述在一次檢測中共同使用。

2.根據權利要求1所述的分枝桿菌檢測鑒定試劑盒，其特征在于，它包括如下試劑：

(1)無水乙醇；

(2)20mg/ml溶菌酶；

(3)DNA提取試劑：5％(w/v)g/mL Chelex 100緩沖液，20mg/mL蛋白酶K；

(4)反應液：PCR Buffer，特異引物SEQ ID NO：1～4，2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，2U/μLHot-start Taq DNA聚合酶；

(5)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，結合緩沖液，退火緩沖液；

(6)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

3.一種權利要求1和2所述的分枝桿菌檢測鑒定試劑盒的檢測方法，其特征在于，它包括如下步驟：

(1)樣本前處理；

(2)提取分枝桿菌DNA；

(3)以步驟(2)所得DNA為模板，利用通用及屏蔽引物進行分枝桿菌16S rRNA可變區的PCR擴增；

(4)步驟(3)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；

(5)將步驟(4)得到的純化的PCR產物進行焦磷酸測序；

(6)測序結果與數據庫比對判斷種屬。

4.根據權利要求3所述的分枝桿菌檢測鑒定試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中的PCR擴增體系為：10×buffer 5μL，SEQ ID No：1 0.06μM，SEQ ID NO：2 0.2μM，SEQID NO：3 0.6μM，SEQ ID NO：4 0.6μM，DNA模板0.2ng，dNTPS 0.2mM，Hot-start Taq DNA聚合酶2U，加去離子水至50μL；PCR擴增條件為：95℃ 3min；94℃ 15s，62℃ 15s，68℃ 30s，45個循環；68℃ 3min。