[發明專利]一種結核分枝桿菌的重組DNA疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 202011047690.8
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112190701A
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 徐穎;翁術鋒;王洪海;趙雅敏;張天然;章金怡
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: A61K39/04
• 分類號: A61K39/04;A61P31/06;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/62
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 王潔平

本發明公開了一種結核分枝桿菌的重組DNA疫苗及其制備方法。本發明的重組DNA疫苗通過將基因Ag85B、Rv2029c和Rv1738重組入真核表達載體獲得。本發明研究發現，免疫6?8周齡C57BL/6雌性小鼠后，DNA疫苗Ag85B?Rv2029c?Rv1738?pVAX1可以顯著提高小鼠外周血中CD4⁺，CD8⁺T淋巴細胞的比例，增加小鼠脾淋巴細胞抗原特異性Th1型細胞因子IL?2，IFN?γ，TNF?α的分泌，降低小鼠肺、脾的BCG細菌計數，提示該重組DNA疫苗可以有效控制分枝桿菌在小鼠體內的生長繁殖。因此，本發明的重組DNA疫苗可用于結核分枝桿菌感染的預防和治療。

技術領域

本發明涉及基因工程和重組DNA疫苗開發技術領域，具體地說，涉及一種結核分枝桿菌的重組DNA疫苗及其制備方法。

背景技術

結核病(TB)是由結核分枝桿菌(MTB)引起的一種嚴重的呼吸道傳染病。根據世界衛生組織《2019年全球結核病報告》，全球約有1000萬新登記的結核病病例，人類免疫缺陷病毒(HIV)陰性人群的結核病死亡人數達到120萬，另有HIV陽性人群死亡25.1萬。此外，據估計，世界人口中約有三分之一患有潛伏性結核感染(LTBI)。

卡介苗(BCG)是目前唯一可用的結核病疫苗，可以有效預防粟粒型結核和結核性腦膜炎。但是其對成人保護效果有限，復種無效。且卡介苗為預防性疫苗，不能對潛伏感染的個體提供有效保護，因此，研制新型結核疫苗迫在眉睫。

多種類型的新型疫苗已被廣泛研究，包括重組BCG疫苗、營養缺陷型結核分枝桿菌疫苗、蛋白質多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒為載體的結核亞單位疫苗等。

發明內容

本發明的目的是提供一種結核分枝桿菌的重組DNA疫苗及其制備方法，該疫苗可補充市售卡介苗性能，控制結核病潛伏感染，有望用于卡介苗初始免疫后的加強免疫用疫苗；控制潛伏感染的治療性疫苗；與藥物聯用控制結核病的治療性疫苗。

本發明中，選取標準株H37Rv中完整的Ag85B，Rv2029c和Rv1738，通過酶切連接于表達載體；其中，重組的Rv1738(285bp,1965657..1965941),Rv2029c(1020bp,2275405..2276424)可以用于潛伏期結核病的血清學檢測，Ag85B(978bp，2134897..2135874)可以用于急性感染期的血清學檢測，因此這些基因都可以作為疫苗的候選基因，本發明將上述基因重組于載體pVAX1，作為DNA疫苗。本發明的技術方案具體介紹如下。

一種結核分枝桿菌的重組DNA疫苗，其通過將基因Ag85B、Rv2029c和Rv1738重組入表達質粒獲得。優選的，表達質粒為pVAX1，重組疫苗為Ag85B-Rv2029c-Rv1738-pVAX1(簡稱為B21)。

本發明進一步提供一種上述的結核分枝桿菌的重組DNA疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)擴增Ag85B、Rv2029c和Rv1738基因；

(2)分別用雙酶切Ag85B基因和表達質粒，膠回收連接獲得重組質粒；

(3)將步驟(2)獲得的重組質粒轉化、擴增并表達；

(4)分別用雙酶切步驟(3)獲得的重組質粒和Rv2029c基因，膠回收連接形成重組質粒；

(5)將步驟(4)獲得的重組質粒轉化、擴增并表達；

(6)分別用雙酶切步驟(5)獲得的重組質粒和Rv1738基因，膠回收連接形成重組質粒；(7)將步驟(6)獲得的重組質粒轉化、擴增并表達，即得到重組DNA疫苗。

優選的，步驟(2)中，表達質粒是pVAX1。