[發(fā)明專利]同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，魏氏梭菌A型的三重PCR引物組及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011046328.9
• 申請(qǐng)日: 2020-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112080572A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李貴陽(yáng);蔣玥;郭龍宗;李玉燕;曲心怡;韓開(kāi)順;沈巍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島英賽特生物科技有限公司;山東益生種畜禽股份有限公司;青島迪諾瓦基因科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42;C12R1/145
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，以及魏氏梭菌A型的三重PCR引物組和試劑盒，其中包含三對(duì)引物，分別是鼠傷寒沙門氏菌上下游引物對(duì)分別是SEQIDNO:1，SEQIDNO:2；腸炎沙門氏菌上下游引物對(duì)分別是SEQIDNO:3，SEQIDNO:4；魏氏梭菌A型引物對(duì)分別是SEQIDNO:5，SEQIDNO:6。利用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，魏氏梭菌A型準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于操作、快速且結(jié)果可靠。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒，腸炎，以及魏氏梭菌A型的三重PCR引物組及試劑盒。

背景技術(shù)

沙門氏菌屬于腸桿菌科，并且是腸桿菌科中血清型最為復(fù)雜的菌屬。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)其血清型可高達(dá)2000多種。能引起禽類感染的沙門氏菌多達(dá)30多種。這些沙門氏菌是造成養(yǎng)禽業(yè)中影響最為嚴(yán)重細(xì)菌性疾病之一，每年給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在養(yǎng)雞行業(yè)中鼠傷寒，腸炎是在沙門氏菌中較為常見(jiàn)的血清型。

雞感染沙門氏菌精神委頓，縮頭頸，閉眼昏睡，絨毛松亂，初期病雞僅表現(xiàn)食欲減少，繼而不食；腹瀉，排白色稀漿樣糞便，有糊堵肛門現(xiàn)象；嚴(yán)重者因呼吸困難或急性敗血癥而死亡。被沙門氏菌感染的禽，不但損害雞的健康，還可通過(guò)禽類產(chǎn)品作為傳播媒介感染人類。引起人類的腸道疾病，嚴(yán)重還會(huì)發(fā)生敗血癥甚至死亡。因此加強(qiáng)對(duì)禽沙門氏菌病的防治，無(wú)論在養(yǎng)禽業(yè)或是公共衛(wèi)生上都有著重要的意義。

魏氏梭菌A型是可造成雞腸道壞死，出血較為多見(jiàn)的血清型，一年四季均可發(fā)病，每年溫度較低的早春和冬季發(fā)病率較高，一經(jīng)發(fā)病迅速發(fā)生死亡。發(fā)病3d后即可出現(xiàn)精神萎頓，羽毛蓬亂，嗜睡，寒顫，食欲減退或廢絕，排黃色，黏性帶血的糞便。但最常引起死亡的雞特征是體格健壯，雞冠眼瞼青紫，少數(shù)蒼白，部分歪頸，步態(tài)僵直等神經(jīng)癥狀。對(duì)中國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成諸多威脅。在感染雞群的魏氏梭菌血清型中A型為優(yōu)勢(shì)血清型。

要想做好沙門氏菌病和魏氏梭菌病的防控，減少經(jīng)濟(jì)損失，快速的檢測(cè)出常見(jiàn)的血清型是防治的前提和基礎(chǔ)。目前想要檢測(cè)雞的腸道細(xì)菌，可在各實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的方法有細(xì)菌鑒別培養(yǎng)法。但想要準(zhǔn)確的鑒別出細(xì)菌混合感染以及復(fù)雜的血清型可通過(guò)免疫印跡技術(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法，核酸雜交技術(shù)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等。這些檢測(cè)方法考慮到特異性，靈敏度，損耗時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，所需費(fèi)用以及日后臨床推廣這些問(wèn)題。最終選定多重PCR法作為本次實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法。多重PCR(multiplex PCR)的原理是在同一PCR反應(yīng)體系中添加二對(duì)及二對(duì)以上的引物，根據(jù)放入引物的對(duì)數(shù)可以相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段。多重PCR這一方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作人員前期摸索最適合的退火溫度，引物比例，最佳反應(yīng)條件。從而確定最適合的反應(yīng)條件。確定好條件的多重試劑盒，在臨床應(yīng)用中檢測(cè)人員只需直接加入待檢的菌液或者核酸。方便快捷，準(zhǔn)確性，特異性高，靈敏度良好，并且大量的節(jié)約了經(jīng)濟(jì)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了更加準(zhǔn)確高效的檢測(cè)出沙門氏菌的常見(jiàn)血清型和魏氏梭菌A型提供了一個(gè)三重PCR檢測(cè)試劑盒，試驗(yàn)結(jié)果表明此方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。有益于各養(yǎng)禽場(chǎng)應(yīng)用以及推廣。

本發(fā)明的方案如下：

同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，以及魏氏梭菌A型的三重PCR引物組，其特征在于，包含三對(duì)引物，分別是鼠傷寒沙門氏菌上下游引物對(duì)分別是SEQIDNO:1，SEQIDNO:2；腸炎沙門氏菌上下游引物對(duì)分別是SEQIDNO:3，SEQIDNO:4；魏氏梭菌A型引物對(duì)分別是SEQIDNO:5，SEQIDNO:6。

引物序列如下：

同時(shí)檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，以及魏氏梭菌A型的三重PCR檢測(cè)試劑盒，試劑盒所涉及的試劑如下：2хTaq MIX12.5μL，鼠傷寒上下游引物各0.6μL，腸炎沙門氏菌上下游引物各0.7μL，魏氏梭菌上下游引物各0.7μL，水4.5μL，模板各1μL，總體積25μL。