[發(fā)明專利]同時檢測鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，魏氏梭菌A型的三重PCR引物組及試劑盒

在審

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• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112080572A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李貴陽;蔣玥;郭龍宗;李玉燕;曲心怡;韓開順;沈巍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島英賽特生物科技有限公司;山東益生種畜禽股份有限公司;青島迪諾瓦基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42;C12R1/145
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1.一種同時檢測鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，以及魏氏梭菌A型的三重PCR引物組，其特征在于，包含三對引物，分別是鼠傷寒沙門氏菌上下游引物對分別是SEQIDNO:1，SEQIDNO:2；腸炎沙門氏菌上下游引物對分別是SEQIDNO:3，SEQIDNO:4；魏氏梭菌A型上下游引物對分別是SEQIDNO:5，SEQIDNO:6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于，鼠傷寒沙門氏菌上游引物，鼠傷寒下游引物；腸炎沙門氏菌上游引物，腸炎沙門氏菌下游引物；魏氏梭菌A型上游引物和魏氏梭菌A型下游引物的摩爾比為1：1：1：1：1：1：。

3.一種同時檢測鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，以及魏氏梭菌A型沙門氏菌的三重PCR試劑盒，其特征在于，含有以下試劑：

A液:

PCR反應(yīng)液含2xTaq PCR Mix 12.5uL、權(quán)利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌上下游引物各0.6μL，腸炎沙門氏菌上下游引物各0.7μL，魏氏梭菌A型上下游引物各0.7uL，ddH₂O 4.5uL，其中引物對濃度均為10uM；

B液：

含有鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，魏氏梭菌A型的目的基因人工質(zhì)粒各50uL，作為陽性對照；

C液：ddH₂O100uL，作為陰性對照。

4.一種同時檢測鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，以及魏氏梭菌A型的三重PCR檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：

(一)待測樣本的核酸提取

提取待測樣本的DNA，-20℃保存；

(二)PCR擴增反應(yīng)體系

將10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、檢測引物組以及步驟(一)提取的樣本DNA模板加入滅菌PCR反應(yīng)管中，添加滅菌雙蒸水至總體積25μl，同時設(shè)置陽性、陰性對照，使用PCR儀進行擴增反應(yīng)；

反應(yīng)體系如下：

2хTaq MIX 12.5μL；

鼠傷寒上下游引物各0.6μL；

腸炎沙門氏菌上下游引物各0.7μL；

魏氏梭菌上下游引物各0.7μL；

模板3μL；

滅菌水補足至總體積25μL；

(三)PCR二步擴增程序：

94℃，2min,98℃，10s,延伸64℃，1min30s循環(huán)30；

(四)PCR的結(jié)果鑒定:

將2μL PCR產(chǎn)物混勻2μL的1×Loading Buffer，將混勻的樣品點進2％的瓊脂糖凝膠中，在120V的電泳儀中跑15min，相對分子質(zhì)量指示是采用DL2000 DNAMarker，最后通過凝膠成像進行結(jié)果分析，

試劑盒判定檢測樣品中是否含有鼠傷寒沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，傷寒沙門氏菌和魏氏梭菌A型，通過觀察電泳檢測圖并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對照，若待測樣品在158bp處出現(xiàn)一條明亮的條帶，陰性對照沒有目的條帶，則證明該待測樣品中存在鼠傷寒沙門氏菌；若待測樣品中在331bp出現(xiàn)一條目的條帶，陰性對照沒有條帶，則證明待測樣品中存在腸炎沙門氏菌；若待測樣品中245bp出現(xiàn)一條目的條帶，陰性對照沒有條帶，證明待測樣品中存在魏氏梭菌A型。