[發(fā)明專利]一種糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法

在審

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• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN112143757A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發(fā)明（設計）人: 陳穎;李光劍;丁曉潔;楊震林;郭威;孫遠;寧明杰
• 申請（專利權）人: 云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院）
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C07K14/47
• 代理公司: 昆明合盛知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

本發(fā)明公開一種糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法，屬于生物醫(yī)藥技術領域。本發(fā)明所述方法利用MUC16特異性的sgRNA定位dCas9到基因組DNA上MUC16基因的啟動子區(qū)，通過dCas9融合的VP64結合MS2?P65?HSF1，在定位點最大程度募集轉錄起始復合體，有效實現(xiàn)MUC16基因的原位轉錄激活；慢病毒系統(tǒng)能夠把過表達的所需元件(MUC16?sgRNA，dCAS?VP64，MS2?P65?HSF1)整合到細胞的基因組DNA中，跟隨細胞分裂復制，實現(xiàn)細胞株MUC16的穩(wěn)定過表達；本發(fā)明實現(xiàn)了常規(guī)載體難以克隆的大分子糖蛋白MUC16的原位穩(wěn)定過表達。

技術領域

本發(fā)明涉及一種糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法，屬于生物醫(yī)藥技術 領域。

背景技術

現(xiàn)有方法中，質粒載體多用于目的基因的瞬時過表達，由于質粒無法整合到 細胞基因組DNA中，目的基因會隨著細胞分裂逐漸丟失。慢病毒載體可以把目 的基因整合到細胞基因組DNA中，實現(xiàn)穩(wěn)定過表達。無論是利用質粒或病毒載 體實現(xiàn)過表達，都需要將目的基因序列克隆到載體中，通過增加基因拷貝數(shù)的方 式提高表達量，克隆片段的大小受載體的容量限制。如果目的基因的mRNA片 段過大，超出載體容量，則不能有效構建。例如：慢病毒載體目的基因的最大極 限是4kb左右。腺病毒載體的最大容量在5-8kb。腺相關病毒只能容納小于3kb 的插入片段。質粒一般只能容納小于10kb的外源DNA片段。一般情況下， 外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉化效率越低。MUC16是一個由 14507個氨基酸組成的大分子糖蛋白，分子量1519175Da，其mRNA長43816bp (相當于約43.8kb)。現(xiàn)有質粒載體和慢病毒載體不適于容納如此大的目的基因。

Lenti-CRISPR-dCas9慢病毒過表達系統(tǒng)適用于蛋白編碼基因和LincRNA， 其中dCas9代表無酶活的Cas9，不剪切基因組DNA。過表達系統(tǒng)包括兩個重要 原件：dCAS-VP64，dCas9和轉錄激活結構域VP64的融合蛋白，以及 MS2-P65-HSF1，三個轉錄激活結構域的融合蛋白；兩者都具備募集轉錄因子激 活表達的功能，二者協(xié)同能最大程度實現(xiàn)基因過表達。Lenti-CRISPR-dCas9慢病 毒系統(tǒng)利用sgRNA定位dCas9到基因組DNA上目標基因的啟動子區(qū)，通過dCas9 融合的VP64結合MS2-P65-HSF1，在定位點最大程度募集轉錄起始復合體，有 效實現(xiàn)基因的原位轉錄激活。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法，使用 Lenti-CRISPR-dCas9系統(tǒng)從基因組DNA上目標基因的啟動子區(qū)直接增強轉錄提 高表達量，無需大片段克隆構建，尤其適用于大基因的過表達，具體包括以下步 驟：

(1)sgRNA的設計：轉錄激活sgRNA的設計要求特異性的靶向目的基因 啟動子區(qū)域，在目標物種基因組DNA上無其他結合位點；因為轉錄起始位點上 游200bp為轉錄激活的最佳區(qū)間，將此區(qū)域的堿基序列輸入設計網(wǎng)站 CRISPRdirect，物種選擇為智人作為參考基因組，得到能夠靶向該區(qū)域的所有 sgRNA，從中篩選出特異性高的sgRNA序列用于載體構建。

MUC16過表達sgRNA的序列：SEQ ID NO.1；

MUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；

MUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；

MUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT。

(2)使用BsmBI消化lenti sgRNA zeo backbone載體，膠回收純化消化好 的載體；對sgRNA退火，將消化好的載體與退火sgRNA進行連接反應。

(3)步驟(2)得到的連接產(chǎn)物直接轉化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)，轉化后的 菌液涂布于帶氨芐抗性(100μg/mL)的LB培養(yǎng)平板；37度靜置培養(yǎng)過夜。