[發(fā)明專利]一種糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011044887.6 | 申請日： | 2020-09-28 |
| 公開（公告）號： | CN112143757A | 公開（公告）日： | 2020-12-29 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳穎;李光劍;丁曉潔;楊震林;郭威;孫遠;寧明杰 | 申請（專利權(quán)）人： | 云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院） |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C07K14/47 |
| 代理公司： | 昆明合盛知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53210 | 代理人： | 龍燕 |
| 地址： | 650000 云*** | 國省代碼： | 云南;53 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 糖蛋白 muc16 原位 穩(wěn)定 表達 方法 | ||
1.一種糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
(1)sgRNA的設(shè)計：將轉(zhuǎn)錄起始位點上游200bp的堿基序列輸入設(shè)計網(wǎng)站CRISPRdirect，選擇智人作為參考基因組，得到能夠靶向該區(qū)域的所有sgRNA，從中篩選出特異性高的sgRNA序列用于載體構(gòu)建；
MUC16過表達sgRNA的序列：SEQ ID NO.1；
MUC16-sgRNA-1：GGTTTCTAAGACATCACACA；
MUC16-sgRNA-2：AGGGAAGAATTGAGATCATC；
MUC16-sgRNA-3：TGAGATTTGGTCTTCTCAAT；
(2)使用BsmBI消化lenti sgRNA zeo backbone載體，膠回收純化消化好的載體；對sgRNA退火，將消化好的載體與退火sgRNA進行連接反應(yīng)；
(3)步驟(2)得到的連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于帶氨芐抗性的LB培養(yǎng)平板；37度靜置培養(yǎng)過夜；
(4)從步驟(3)中的培養(yǎng)平板中挑取單克隆，接種于帶氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，經(jīng)過測序鑒定得到插入sgRNA的載體lenti sgRNA；
(5)步驟(4)得到的載體和包裝載體一同使用包裝慢病毒，然后利用包裝好的慢病毒感染目的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法，其特征在于：慢病毒包裝的具體過程為：
①提前24小時用多聚賴氨酸poly-L-lysine包被細胞培養(yǎng)皿并晾干，以促進包裝細胞貼壁；
②將5-8×106數(shù)量級的包裝細胞懸于10ml完全培養(yǎng)基，鋪到前期用多聚賴氨酸包被過的10cm2培養(yǎng)皿中；
③第二天當細胞融合度達到65％～80％時，棄去培養(yǎng)基用無菌PBS洗3遍，更換為含10％FBS的無抗生素培養(yǎng)基；
④將pVSVG包膜質(zhì)粒，pSPAX包裝質(zhì)粒及載體lenti sgRNA按比例混合于無抗生素無血清的opti-MEM培養(yǎng)基中；各質(zhì)粒比例：pVSVG:1μg，pSPAX:3μg，lenti dCAS-VP64_Blast:1.5μg，lenti MS2-P65-HSF1_Hygro：1.5μg,lenti sgRNA(MS2):1.5μg，3個sgRNA等比例混合；
⑤轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，提前溶于等體積的無抗生素無血清的opti-MEM培養(yǎng)基中，隨后與質(zhì)粒混合體系充分混勻，室溫靜置反應(yīng)20-30min，形成的DNA脂質(zhì)體復合物均勻滴加到包裝細胞培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染包裝細胞；
⑥24小時后更換完全培養(yǎng)基，隨后的48、72小時收獲含慢病毒的培養(yǎng)上清，病毒培養(yǎng)上清需分裝后于-80℃保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述糖蛋白MUC16原位穩(wěn)定過表達方法，其特征在于：用慢病毒載體感染目的細胞的具體過程為：
①慢病毒培養(yǎng)上清靜置于冰上緩慢化凍，化凍后仍然置于冰上；
②含慢病毒的培養(yǎng)上清需與等體積的完全培養(yǎng)基混勻以補充營養(yǎng)物質(zhì)，并添加基因轉(zhuǎn)染增強劑polybrene至最終濃度為8ug/ml；
③目的細胞提前一天傳代，當目的細胞達到55-75％融合度時棄去原培養(yǎng)液，加入混合好的慢病毒培養(yǎng)上清，讓病毒感染目的細胞，培養(yǎng)過夜后首先用無菌PBS洗3遍，然后更換為完全培養(yǎng)基讓目的細胞繼續(xù)生長；
④感染72小時后收獲細胞用于后續(xù)檢測。
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