[發(fā)明專利]一種區(qū)分檢測花生黑腐病菌和花生基腐病菌的雙重PCR檢測引物及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011044315.8
• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN112143825B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 紀春艷;敖莉絲;馮黎霞;潘汝謙;王衛(wèi)芳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué);廣州海關(guān)技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發(fā)明公開了一種區(qū)分檢測花生黑腐病菌和花生基腐病菌的雙重PCR檢測引物及應(yīng)用，所述引物包括一對針對花生黑腐病菌的特異性引物CC?F和CC?R，以及一對針對花生基腐病菌的特異性引物NC?F和NC?R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示。本發(fā)明所提供的雙重PCR引物特異性強，建立的雙重PCR體系能夠從花生黑腐病菌及花生基腐病菌中擴增到相應(yīng)的單一目的條帶。本發(fā)明所建立的雙重PCR方法可穩(wěn)定、快速、特異、簡便地檢測花生植株中是否有引致癥狀難以區(qū)分的黑腐病/基腐病的單一/混合的相應(yīng)病原菌，具有很好的應(yīng)用前景和推廣價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物病菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種區(qū)分檢測花生黑腐病菌和基腐病菌的雙重PCR引物及其快速檢測方法和試劑盒。

背景技術(shù)

花生黑腐病是由進境檢疫性有害生物-冬青麗赤殼(Calonectria ilicicola，無性態(tài)為寄生帚梗柱孢霉Cylindrocladium parasiticum)引起的一種真菌性病害，該病害為害花生的果針、莢果和根系，造成受害部位變黑腐爛，植株萎蔫死亡，是威脅花生健康生產(chǎn)的重要病害。花生黑腐病最早于1965年在美國喬治亞州首次報道，該病害傳播迅速且難以防治，目前包括日本、韓國和澳大利亞等30多個國家均有發(fā)生。2009年，在我國的廣東省首次發(fā)現(xiàn)花生黑腐病，隨后該病害迅速蔓延至我國的江西省和福建省等地區(qū)，對我國的花生生產(chǎn)造成嚴重威脅(Pan et a l，2012；Gai et al，2012)。此外，黑腐病菌還可以侵染大豆引致紅冠腐病，以及為害中華獼猴桃和紫花苜蓿等20多種植物(Guan et al，2010)。花生黑腐病菌屬于高度風(fēng)險性有害生物，對我國花生和大豆等作物的安全生產(chǎn)造成嚴重威脅(潘汝謙等，2012)。2007年，花生黑腐病菌(C.parasiticum)被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》；2010年，被增列入《廣東省農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物補充名單》。

花生基腐病由侵管新赤殼菌(Fusarium neocosmosporiellum)引起。花生基腐病菌及黑腐病菌為害花生所引致的田間癥狀類似，均造成植株莖基部和根系變黑腐爛，在病株莖基部均可產(chǎn)生成簇的(橘)紅色子囊殼。花生黑腐病和基腐病都是典型的土傳和種傳病害，這兩種病害一旦發(fā)生，生產(chǎn)上防控極為困難，病害的早期診斷對防止病害傳播蔓延和病害防控尤為重要。花生黑腐病菌的傳統(tǒng)檢測方法包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和分子生物學(xué)等方法，這些方法檢測時間長，需要一定的專業(yè)鑒定知識支撐。此外，在田間，病害往往是由多種病原菌復(fù)合侵染引致，這增加了檢測的復(fù)雜度。目前，針對花生黑腐病菌的LAMP分子檢測技術(shù)雖已有報道，但是該研究方法只限于檢測1種病菌，對癥狀類似的花生黑腐病及花生基腐病尤其難以區(qū)分和準確診斷，不能夠滿足檢疫口岸和田間基層的快速、準確診斷的迫切需求。因此，非常有必要建立一套能夠快速、靈敏、準確的同時區(qū)分花生黑腐病菌及花生基腐病菌的檢測診斷技術(shù)，為病害的早期診斷提供技術(shù)支持。

多重PCR(polymerase chain reaction)是在同一個反應(yīng)體系對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴增多個目的片段的PCR技術(shù)，能夠一次實現(xiàn)對多種病原菌的檢測，其特點是耗時短的同時提高準確性和靈敏度。多重PCR技術(shù)具有節(jié)省時間、降低成本和提高效率的優(yōu)勢，在植物病原菌的鑒定和檢測，尤其是對癥狀類似或病原菌復(fù)合侵染的檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。但是目前還未見有同步區(qū)分檢測花生黑腐病菌和花生基腐病菌的報道。因此，本領(lǐng)域亟需建立一種簡單快速、特異性好、靈敏度高的用于區(qū)分檢測花生黑腐病菌和花生基腐病菌的雙重PCR技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于區(qū)分檢測花生黑腐病菌和花生基腐病菌的雙重PCR檢測引物及其檢測方法，所述方法具有快速、準確、靈敏度強等特點。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于區(qū)分檢測花生黑腐病菌和花生基腐病菌的雙重PCR檢測引物。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述雙重PCR檢測引物在檢測花生黑腐病菌和/或花生基腐病菌中的應(yīng)用。