[發(fā)明專利]一種微小核酸聯(lián)合擴(kuò)增檢測(cè)方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011041856.5
• 申請(qǐng)日: 2020-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112501289A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳燃;徐逸麗;楊穎浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州復(fù)杏生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

1.一種微小核酸聯(lián)合擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)設(shè)計(jì)合成模板探針。模板探針是一段人工合成的寡核苷酸單鏈DNA，其序列結(jié)構(gòu)，從5’端至3’端包括3個(gè)區(qū)域，依次是：上游引物同源區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、下游引物結(jié)合區(qū)，全部區(qū)域都設(shè)計(jì)為微小核酸結(jié)合區(qū)，可以連續(xù)結(jié)合2～4種微小核酸，2個(gè)看家基因微小核酸結(jié)合區(qū)分別位于上游引物同源區(qū)和下游引物結(jié)合區(qū)，2個(gè)疾病特異微小核酸結(jié)合區(qū)位于擴(kuò)增區(qū)；

(2)從血液、體液、細(xì)胞、已磨碎的組織等初始樣品通過(guò)裂解、保溫、離心或柱純化等步驟得到初步純化的核酸樣品，模板探針可以添加在本步驟，同步完成模板探針與微小核酸的雜交結(jié)合；

(3)將上一步得到的核酸樣品與含有綠豆核酸酶、氯化鈉、乙酸鈉、Zn²⁺的反應(yīng)體系混合保溫一段時(shí)間，與目標(biāo)微小核酸完全結(jié)合的模板探針形成雙鏈核酸，而不會(huì)被酶切；沒(méi)有被目標(biāo)微小核酸完全結(jié)合或者存在錯(cuò)配的非特異雜交結(jié)合的模板探針均不能形成雙鏈保護(hù)而被酶切；

(4)對(duì)上一步反應(yīng)完成后的樣品進(jìn)行核酸純化，得到核酸樣品，其中包含與目標(biāo)微小核酸形成雙鏈核酸的模板探針；

(5)將第四步得到的樣品，與熒光定量PCR體系混合，其中包含上游引物、下游引物及與擴(kuò)增區(qū)同源或結(jié)合的熒光探針或熒光染料、Taq DNA聚合酶等其它常規(guī)PCR組分，然后，在PCR熱循環(huán)儀上，以常規(guī)PCR程序進(jìn)行PCR反應(yīng)，該反應(yīng)以模板探針互補(bǔ)鏈為模板，上下游引物為引物，Taq DNA聚合酶催化進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性結(jié)果(有擴(kuò)增，即有Ct值)指示目標(biāo)微小核酸的同時(shí)存在于初始樣品中，陰性結(jié)果(無(wú)擴(kuò)增，即無(wú)Ct值)指示。

2.如權(quán)利要求1所述的微小核酸聯(lián)合擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中所述裂解液組成如下：10mM ZnCl₂、3mM CTAB、5％(v/v)Triton X-100、8％(v/v)甲酰胺、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM乙酸鈉pH 4.7。

3.如權(quán)利要求1所述的微小核酸聯(lián)合擴(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中所述反應(yīng)組成如下：pH5.0的50mM乙酸鈉緩沖液中含有30mM NaCl、1mMZnCl₂、0.05U/μl綠豆核酸酶。

4.一種微小核酸聯(lián)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于嗎，所述試劑盒包括吸附柱、收集管、處理液，包括：

(1)吸附柱和收集管的作用是吸附核酸和收集柱純化步驟產(chǎn)生的廢液；

(2)處理液1是裂解液，組成為：10mM ZnCl₂、3mM CTAB、5％(v/v)TritonX-100、8％(v/v)甲酰胺、0.1mg/ml蛋白酶K、150mM NaAc pH 4.7，在使用前加入1/10體積的100nM模板探針，作用是裂解血液、體液、細(xì)胞、已磨碎的組織等初始樣品，釋放出核酸，并同步完成微小核酸與模板探針的雜交結(jié)合；

(3)處理液2是洗滌液，組成為：pH 5.0的25mM乙酸鈉，使用前用75％乙醇稀釋25倍，作用是從吸附柱洗滌去除雜質(zhì)；

(4)處理液3是酶切液，組成為：pH5.0的50mM乙酸鈉緩沖液中含有30mMNaCl、1mM ZnCl₂、0.05U/μl綠豆核酸酶，作用是酶切降解未完全互補(bǔ)結(jié)合目標(biāo)微小核酸的模板探針；

(5)處理液4是洗脫液，組成為：50mM Tris-HCl pH7.7、50mM KCl、5mMMgCl₂、5mM 2-ME、0.4mM dNTP、3％(v/v)甲酰胺，作用是從吸附柱洗脫核酸，并給后續(xù)反應(yīng)提供Mg²⁺和dNTP；

(6)處理液5是PCR液，組成為：pH 8.3的50mM Tris-HCl、25mM KCl、0.06U/μl Taq DNA聚合酶、0.8×SYBR Green I、0.1mM EDTA-Na2、5％(v/v)甲酰胺、6％(v/v)甘油，在使用前加入1/10體積的4μM PCR上、下游引物，并按15μl體積分裝至PCR管中備用，作用是進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。