[發(fā)明專利]一種微小核酸聯(lián)合擴增檢測方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011041856.5
• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN112501289A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳燃;徐逸麗;楊穎浩
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州復杏生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京卓特專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11572
• 代理人: 段宇

本發(fā)明提供了一種微小核酸聯(lián)合檢測方法及試劑盒，利用單鏈模板探針雜交捕獲多個目標微小核酸，通過綠豆核酸酶酶切去除過量單鏈模板探針，純化得到與目標微小核酸形成雙鏈的模板探針，再進行PCR擴增檢測，陽性擴增結(jié)果指示目標微小核酸的存在。本發(fā)明將微小核酸檢測的PCR前處理步驟減少至3步，將通量提高至傳統(tǒng)PCR法的4倍，并且避免基因組DNA、初級前體、次級前體、雙鏈前體的干擾，有利于改善和推進微小核酸檢測的普及應(yīng)用。

1技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種微小核酸聯(lián)合擴增檢測方法(miRNACombined Amplification Protocol，MCAP)，及利用該方法進行微小核酸檢測的試劑盒，以及該方法和試劑盒在體外診斷和鑒定中的應(yīng)用。

2背景技術(shù)

微小核酸miRNA(microRNA，微小核糖核酸)是一類進化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，長約22個核苷酸(nt)，廣泛存在于真核生物包括人體及源于人體的組織、血液、體液內(nèi)，由基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級前體pri-miRNA經(jīng)剪切得到的次級前體pre-miRNA，再次剪切得到雙鏈前體(miRNA duplex)，最后解鏈而得到。miRNA在體內(nèi)具有多種重要的基因調(diào)節(jié)功能，其表達異常與各種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。miRNA作為分子標記物應(yīng)用于腫瘤早期篩查和診斷、預(yù)后判斷以及藥物選擇、療效檢測，有著獨特的優(yōu)勢，非常適合成為腫瘤液體活檢靶標：(1)miRNA可在血液等體液中穩(wěn)定富集易被檢出。腫瘤細胞產(chǎn)生miRNA并通過微囊泡和外泌體等分泌機制分泌進入血液等體液中；且有微囊泡和外泌體的包被膜或RNA結(jié)合蛋白包裝保護，因此，能在血液等體液中穩(wěn)定富集存在，不易被降解，并可耐受反復凍融和極端pH環(huán)境等處理過程，而易被檢出。(2)血液異常富集的miRNA可發(fā)生在腫瘤早期階段。血液異常富集的miRNA來源于組織原位腫瘤細胞的表達和分泌，并不需要腫瘤細胞本身轉(zhuǎn)移進入血液，因此，可發(fā)生在腫瘤早期階段。循環(huán)腫瘤細胞(CTC)和游離DNA(ctDNA)則是腫瘤細胞直接轉(zhuǎn)移進入血液的結(jié)果，而這一般發(fā)生在腫瘤晚期階段。因此，miRNA檢測能應(yīng)用于腫瘤早期階段，而CTC和ctDNA檢測一般只適用于腫瘤晚期階段。(3)miRNA組合表達具有高度的特異性。miRNA可在腫瘤組織的不同來源甚至不同分期，呈現(xiàn)出不同的表達組合，具有組織來源和分期特異性，因此，血液miRNA組合檢測檢測可以判斷腫瘤組織來源，甚至可以進一步應(yīng)用于腫瘤分期診斷。(4)miRNA檢測可利用PCR擴增在高特異性基礎(chǔ)上達到很高的靈敏度，診斷價值高。而腫瘤檢測常用的血液蛋白質(zhì)標志物，如：常規(guī)腫瘤標志物和自身抗體等，不是惡性腫瘤的特異性標志，靈敏度有限，在診斷上只有輔助價值。