[發明專利]基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法

在審

• 申請號: 202011040182.7
• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN114277161A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 徐瓊;俞漪;顧晨榮;劉洋;張娜娜;竇同海;吳群峰;翁史昱;鐘江;祝海軍;杜雪柯;趙磊;封金美
• 申請（專利權）人: 上海市質量監督檢驗技術研究院;上海昂樸生物科技有限公司;泰州昂樸醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/01
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

1.一種基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，先提取殺菌型乳制品的DNA，然后通過高通量測序技術結合生物信息學方法分析殺菌型乳制品中益生菌攜帶的耐藥基因。

2.如權利要求1所述的基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、提取殺菌型乳制品的DNA；

步驟二、采用高通量測序技術獲得所述殺菌型乳制品的DNA的原始序列；

步驟三、采用高通量測序技術獲得所述殺菌型乳制品的DNA的優化序列；

步驟四、采用高通量測序技術對優化序列進行拼接組裝和基因預測，并結合生物信息學方法進行物種和功能上的注釋以及分類，從而獲得菌型乳制品中乳酸菌耐藥基因。

3.如權利要求2所述的基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，所述步驟三的優化序列是對步驟二的原始序列進行拆分、質量剪切以及去除污染等優化處理獲得。

4.如權利要求1-3任一項所述的基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，步驟一所述的殺菌型乳制品的DNA的提取方法，包括：

步驟A、預處理：將所述的殺菌型乳制品的DNA樣品與無菌蒸餾水以體積比為1:9的比例混勻，取5-10mL的樣品加入到離心管中，高速離心，去上清；沉淀中加入5mL無菌蒸餾水，在渦旋振蕩器上將沉淀混勻，混勻液放在沸水中加熱，直至蛋白質絮狀物出現，高速離心，去上清；沉淀中加入5mL無菌蒸餾水溶解，渦旋振蕩器上混勻，再次在沸水中加熱10min，高速離心，去上清。

5.如權利要求4所述的基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，預處理步驟中的高速離心方式為9000g離心5min。

6.如權利要求4所述的基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，所述殺菌型乳制品DNA的提取方法，還包括：

步驟B、往預處理后的沉淀中加入400μL濃度為10mg/mL的溶菌酶與20μL蛋白酶K，37℃水浴2小時；再加入400μL CTAB，56℃水浴過夜；

步驟C、樣品中加入體積比為25:24:1的tris酚：三氯甲烷：異戊醇，高速離心；

步驟D、將上清移至新的離心管中，并加入體積比為24:1的三氯甲烷：異戊醇，13000rpm離心10min；

步驟E、將上清移至新的離心管中，加入2倍體積的無水冰乙醇；并在冰箱冷凍室放置20min左右；

步驟F、取出離心管，高速離心，去上清，在沉淀中加入1mL70％的乙醇清洗2-3次，沉淀晾干，加入50μL的TE溶解，得到DNA溶液，-20℃保存備用。

7.如權利要求6所述的基于高通量測序技術快速獲得殺菌型乳制品中益生菌耐藥基因的方法，其特征在于，步驟C采用13000rpm高速離心10min，步驟F采用13000rpm高速離心5min。