[發(fā)明專利]一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011039170.2
• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN112080478B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設計）人: 林德銳;陳堅;李永紅;韓翡;巫月生;涂玉蓉;李靜;肖永珍;余玲娜;陳漢林
• 申請（專利權）人: 廣東永順生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

本發(fā)明涉及一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法及應用，主要涉及種毒稀釋液的改進，本發(fā)明以磷酸緩沖液為基礎，通過添加天冬氨酸、ZnCl2和表皮生長因子，實現(xiàn)了H5亞型禽流感病毒在SPF雞胚和非免雞胚中的高效增殖，其在疫苗制備過程中，僅需要進行離心和過濾處理即可得到符合生產標準的抗原，且也能達到傳統(tǒng)生產工藝經濃縮后的抗原液同樣的病毒含量和HA效價，免疫后的HI抗體水平也與傳統(tǒng)工藝無顯著差異。其相比傳統(tǒng)工序，無需進行濃縮處理，其節(jié)約了生產成本，特別是濃縮設備和濃縮工藝費用，提高了生產效率，且可以降低產品生產中的污染風險。

技術領域：

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法及應用。

背景技術：

禽流感（Avian Influenza）是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病，被OIE定為I類傳染病，其是以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，常常導致家禽發(fā)病甚至死亡，亦可感染哺乳動物和人。根據(jù)禽流感病毒致病能力的差異，可將禽流感分為低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI），其中H5亞型是HPAI之一，禽類是H5N1病毒的天然宿主，研究表明H5N1禽流感病毒可以打破物種屏障，更容易使哺乳動物致病，造成大流行。世界不同國家采取撲殺或疫苗免疫進行有效防控H5N1等HPAI，我國H5N1亞型禽流感滅活疫苗對雞和水禽均具有良好的免疫效果。

在禽流感疫苗生產中，目前主要依靠雞胚法，通常采用SPF雞胚或者非免雞胚進行培養(yǎng)，然而，在培養(yǎng)過程中，存在病毒培養(yǎng)含量低的問題，通常需要通過濃縮的方法實現(xiàn)，但是，一方面，濃縮會導致生產線的延長，增加生產成本，另一方面，在濃縮過程中可能會增加污染的幾率。因此，基于節(jié)約生產成本和提高疫苗質量的考慮，各疫苗生產企業(yè)致力于研究如何提高病毒的含量，如發(fā)明專利申請CN201611170075X（公開號：CN106754750A）即提出了一種H5亞型禽流感病毒的增殖方法，在種毒接種過程中采用由氨基酸混合物和維生素混合物組成的磷酸鹽緩沖液，可以有效提高尿囊液中的病毒含量，其豐富了禽流感疫苗的制備方法。基于禽流感病毒，特別是H5N1亞型的高致病性，其對于SPF雞胚和非免雞胚的致死性比較強，生產過程中通常接種后雞胚的死亡率高達5%以上，對于生產效率具有較大的影響。

發(fā)明內容：

基于現(xiàn)有H5亞型禽流感病毒雞胚培養(yǎng)滴度低，以及在接種后雞胚的死亡率高的問題，本發(fā)明旨在提供一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法，所述方法能夠提升雞胚培養(yǎng)時尿囊液中的病毒含量以及尿囊液的產量，同時降低雞胚的死亡率，對于生產效率的提升具有積極意義。

一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法，其是將所述方法是將 H5亞型禽流感病毒毒種用種毒稀釋液稀釋后接種于SPF雞胚或非免雞胚，接種后置 36～37℃繼續(xù)孵育 72-96 小時，收獲活胚的雞胚液，經離心、過濾后得到 H5亞型禽流感病毒原液，其特征在于，所述種毒稀釋液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂ 和表皮生長因子的磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明還請求保護一種生產H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的方法，包括利用SPF雞胚或非免雞胚生產H5亞型禽流感病毒原液，經滅活后，向滅活的病毒液中加礦物油佐劑混合乳化制成H5亞型禽流感病毒滅活疫苗，所述生產H5亞型禽流感病毒原液的方法是將H5亞型禽流感病毒毒種用種毒稀釋液稀釋后接種于非免雞胚，接種后置36～37℃繼續(xù)孵育72-96小時，收獲活胚的雞胚液，經離心、過濾后得到H5亞型禽流感病毒原液，其特征在于，所述種毒稀釋液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生長因子的磷酸鹽緩沖液。

所述磷酸鹽緩沖液按照如下方法配制：取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄﹒12H₂O2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，將以上試劑依次溶解于800mL雙蒸餾水中，邊加邊攪拌使其溶解，然后用NaOH或HCl調節(jié)至pH 7.4，最后加雙蒸水至1000mL，滅菌備用。