[發明專利]一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法及應用

有效

• 申請號: 202011039170.2
• 申請日: 2020-09-28
• 公開（公告）號: CN112080478B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 林德銳;陳堅;李永紅;韓翡;巫月生;涂玉蓉;李靜;肖永珍;余玲娜;陳漢林
• 申請（專利權）人: 廣東永順生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺

1.一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖用種毒稀釋液，所述種毒稀釋液是添加了天冬氨酸、ZnCl₂ 和表皮生長因子的磷酸鹽緩沖液；所述種毒稀釋液中天冬氨酸的濃度為1.5mg/mL，ZnCl₂的質量百分比為0.05mg/mL，表皮生長因子濃度為1.5ng/mL。

2.根據權利要求1所述的種毒稀釋液，其特征在于，所述種毒稀釋液采用如下方法制備得到：按照天冬氨酸的濃度為1.5mg/mL，ZnCl₂的質量百分比為0.05mg/mL，表皮生長因子濃度為1.5ng/mL的濃度將天冬氨酸、ZnCl₂和表皮生長因子與磷酸鹽緩沖液混合，采用0.22μm的濾器過濾除菌，4℃下保存，備用。

3.一種H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法，其是將所述方法是將 H5亞型禽流感病毒毒種用權利要求1-2中任一項所述的種毒稀釋液稀釋后接種于SPF雞胚或非免雞胚，接種后置 36～37℃繼續孵育 72-96 小時，收獲活胚的雞胚液，經離心、過濾后得到 H5亞型禽流感病毒原液。

4.根據權利要求3所述的H5亞型禽流感病毒的高效增殖方法，所述H5亞型禽流感病毒為重組禽流感病毒H5N1亞型Re-11株。

5.一種生產H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的方法，包括利用SPF雞胚或非免雞胚生產H5亞型禽流感病毒原液，經滅活后，向滅活的病毒液中加礦物油佐劑混合乳化制成H5亞型禽流感病毒滅活疫苗，所述生產H5亞型禽流感病毒原液的方法是將H5亞型禽流感病毒毒種用權利要求1-2中任一項所述的種毒稀釋液稀釋后接種于非免雞胚，接種后置36～37℃繼續孵育72-96小時，收獲活胚的雞胚液，經離心、過濾后得到H5亞型禽流感病毒原液。

6.根據權利要求5所述的生產H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的方法，所述H5亞型禽流感病毒為重組禽流感病毒H5N1亞型Re-11株。

7.根據權利要求6所述的生產H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟一，取H5亞型禽流感病毒毒種用權利要求1-2中任一項所述的種毒稀釋液作10倍系列稀釋，取10^-4稀釋度的病毒液，尿囊腔內接種10～11日齡非免雞胚，每胚0.1ml，接種后置36～37℃繼續孵育，不必翻蛋；

步驟二，雞胚接種后，每日照蛋2次，將在24小時前死亡的雞胚棄去，24小時以后死亡的雞胚隨時取出，至72小時，將活胚全部取出，氣室向上直立，置于2～8℃冷庫冷卻12～24小時；

步驟三，將冷卻12～24小時的雞胚取出，表面消毒后，將其推入收獲操作間，采用全自動收獲機對活胚吸取雞胚液，每若干個雞胚的胚液混合為一組，在收獲胚液的同時，應逐個檢查雞胚，如胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者棄去不用；

步驟四，收獲后的胚液置于滅菌瓶中，每組抽樣測定血凝價，血凝價應不低于1:256，并逐瓶抽樣2～3ml留樣，收獲的胚液滅活前置2~8℃保存，應不超過3日；

步驟五，將檢驗合格的雞胚液通過離心機離心后，混合于一個儲存罐內，在無菌條件下用滅菌的二級預過濾柱濾過，除去病毒液的殘渣和其他雜質，取樣測定毒價，其HA效價不低于1：512；

步驟六，采用甲醛滅活，準確量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均勻，然后往雞胚液加入甲醛溶液，隨加隨攪拌，使其充分混合，按抗原量計，使甲醛最終濃度為0.2%，甲醛加入完畢后，啟動儲存罐升溫系統，抗原溫度達到37℃時，將抗原倒到另一個已滅菌的滅活罐內開始計時，滅活24小時，期間不停攪拌，至滅活24小時，取樣做無菌檢驗和滅活檢驗；

步驟七，向滅活的病毒液中加礦物油佐劑混合乳化制成H5亞型禽流感病毒滅活疫苗。