[發(fā)明專利]通過IGFBP5介導(dǎo)動脈粥樣化的動物模型及建立方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011033316.2
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112111521B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 相奧琪;梁國朵;余琦;張云婷
• 申請（專利權(quán)）人: 西安醫(yī)學院
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;A01K67/027
• 代理公司: 西安弘理專利事務(wù)所 61214
• 代理人: 寧文濤

1.通過IGFBP5介導(dǎo)的動脈粥樣硬化動物模型，其特征在于，所述動物模型通過外源注射腺相關(guān)病毒系統(tǒng)性高表達IGFBP5得到。

2.一種權(quán)利要求1所述的通過IGFBP5介導(dǎo)的動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

步驟1、構(gòu)建腺相關(guān)病毒表達載體AAV-IGFBP5；

步驟2、將步驟1得到的所述腺相關(guān)病毒載體AAV-IGFBP5通過肌肉注射到ApoE^-/-小鼠中，注射后采用高脂飼料喂養(yǎng)6周，6周后得到的小鼠即得到本發(fā)明的動物模型。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過IGFBP5介導(dǎo)的動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1中腺相關(guān)病毒表達載體AAV-IGFBP5具體構(gòu)建步驟如下：

步驟1.1、采用根據(jù)已知目的基因IGFBP5 cDNA序列設(shè)計合成擴增引物，上游引物如SEQID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，用PCR法擴增目的基因IGFBP5，擴增條件：98℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min，35個循環(huán)；72℃，10min；4℃，5min，擴增完畢用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；

步驟1.2、將步驟1.1所得的目的基因PCR產(chǎn)物用Bam HI、Xhol內(nèi)切酶雙酶切，同時用這兩種酶內(nèi)切酶切割rAAV載體，將切割后的目的基因與rAAV載體混合，用T4 DNA連接酶在4℃的條件下連接12h，將連接得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)Kan+LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，對得到的重組質(zhì)粒進行陽性克隆鑒定；

步驟1.3、采用驟1.2鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆、搖菌和質(zhì)粒提取，所提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細胞，培養(yǎng)72h后將細胞離心收集，在4℃的條件下，于53 000r/min高速離心30h，收集富含rAAV的細胞上清液；

步驟1.4、將步驟1.3中得到的細胞上清液加入樹脂柱進行柱純化，收集最終得到的純化后的病毒，于-80℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過IGFBP5介導(dǎo)的動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟1.3中轉(zhuǎn)染前1天將HEK293細胞于直徑為100mm的培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染時細胞密度75％-85％。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過IGFBP5介導(dǎo)的動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中高脂飼料的膽固醇和脂肪量均為1.5％cholesterol+15％fat。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過IGFBP5介導(dǎo)的動脈粥樣硬化動物模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中注射入ApoE^-/-小鼠的腺相關(guān)病毒表達載體AAV-IGFBP5的濃度是1×10¹¹vp/mL。