[發明專利]具有高活性的殼聚糖酶及其制備和應用

在審

• 申請號: 202011029877.5
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112111473A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 乞鋒輝;楊曉民;劉學珍;脫世華;靳曉偉
• 申請（專利權）人: 河北灃川生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N1/20;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊海天知識產權代理有限公司 13101
• 代理人: 田文其

本發明屬于微生物發酵，特別是指一種具有高活性的殼聚糖酶及其制備和應用。是將殼聚糖酶生產菌種接種到滅菌后且含有碳源、氮源及必要營養物質的發酵培養基，調節發酵培養基的pH于溫度為35℃?37℃通氣發酵；發酵中流加氨水控制pH，流加補入葡萄糖溶液控制培養基中葡萄糖濃度；當發酵培養基的OD₆₀₀≥30時，加入誘導劑誘導培養同時將發酵溫度降至30℃?33℃；當發酵液中酶活不再增長或發酵周期≤30小時發酵結束制成含有殼聚糖酶的發酵液，經高壓均質、離心得到含有殼聚糖酶的粗酶液。本發明解決了現有技術中殼聚糖酶酶活低的問題，具有所制備的殼聚糖酶酶活高，所降解殼寡糖分子量小，發酵及降解工藝簡單等優點。

技術領域

本發明屬于微生物發酵，特別是指一種具有高活性的殼聚糖酶及其制備和應用。

背景技術

殼寡糖又名氨基葡萄糖，通過β-1-4糖苷鍵連接而成，由來源于蝦蟹殼的殼聚糖生物降解得到的聚合度為2-20的功能性寡糖。是自然界唯一的帶正電荷、陽離子堿性氨基低聚糖。殼寡糖具有獨特的生理活性和功能性，具有抑菌、抗癌、降血糖降血脂、調節內分泌、排除重金屬等功能。由于殼寡糖水溶性好，功能作用大，生物活性高，近年來針對殼寡糖生產和應用的研究越來越受到重視。

殼寡糖的制備的常用方法包括物理降解法、化學法和酶法。物理降解法反應不充分，收率低；化學降解法易水解出大量氨基葡萄糖單體，化學試劑易造成設備腐蝕和環境污染；酶降解法因反應條件溫合，過程易控制，產物相對均一，環境污染小，具有較好的發展前景。

殼聚糖酶是專一性水解殼聚糖的酶，可以催化水解殼聚糖的β-1-4糖苷鍵得到殼寡糖。1973年Monaghan首次發現了殼聚糖酶，經過近30年的研究發現，殼聚糖酶廣泛分布于細菌、真菌、病毒以及植物等生物群中。

申請人檢索的現有文獻包括：

如趙玉巧等通過優化XK-3殼聚糖酶菌株培養條件，得到殼聚糖酶活力為3430U/L，公開號為CN102816751A的專利文獻中采用蠟狀芽孢桿菌進行深層液體發酵，得到粗酶活性227U/ml，純化的殼聚糖酶制劑酶活25000U/g。

雖然現有殼聚糖酶工業化生產取得了許多成果，但還存在酶活力較低，應用性能較差，產物聚合度不可控，使用成本高等問題。為了進一步滿足工業生產需求，開發研究生產工藝簡單、酶活性高，制作殼寡糖操作簡單、快速的殼聚糖酶勢在必行。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有高活性的殼聚糖酶及其制備和應用，選用殼聚糖酶生產菌種，并對發酵工藝進行優化，使本發明所制備的未經純化的殼聚糖酶粗酶液具有較高的酶活，并能將殼聚糖降解制備成平均相對分子量＜1000的殼寡糖。

本發明的整體技術構思是：

具有高活性的殼聚糖酶，其特征在于其未經純化的粗酶酶活≥683U/ml,未經純化的粗酶能將殼聚糖降解制備成平均相對分子量≤1000的殼寡糖。

具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，是將殼聚糖酶生產菌種接種至滅菌后且含有碳源、氮源及必要營養物質的發酵培養基中培養制成含有殼聚糖酶的發酵液；包括如下步驟：

A、殼聚糖酶生產菌種選用拉丁文名稱為Escherichia coli，保藏編號為CGMCCNo.19765的埃希氏大腸桿菌；

B、調節接種后的發酵培養基的pH＝6.8～7.2，于溫度為35℃～37℃的條件下進行通氣發酵；發酵過程中通過流加氨水控制pH＝6.8～7.2，當發酵培養基中葡萄糖質量百分濃度＜0.5％時，流加補入葡萄糖溶液；

C、當發酵培養基的OD₆₀₀≥30時，加入濃度為0.1mmol/L～0.5mmol/L誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導培養，同時將發酵溫度降至30℃-33℃；當發酵液中酶活不再增長或發酵周期≤30小時發酵結束制成含有殼聚糖酶的發酵液；