[發(fā)明專利]具有高活性的殼聚糖酶及其制備和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011029877.5
• 申請(qǐng)日: 2020-09-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112111473A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 乞鋒輝;楊曉民;劉學(xué)珍;脫世華;靳曉偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北灃川生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N1/20;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊海天知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 13101
• 代理人: 田文其

1.具有高活性的殼聚糖酶，其特征在于其未經(jīng)純化的粗酶酶活≥683U/ml,未經(jīng)純化的粗酶能將殼聚糖降解制備成平均相對(duì)分子量≤1000的殼寡糖。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，是將殼聚糖酶生產(chǎn)菌種接種至滅菌后且含有碳源、氮源及必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)制成含有殼聚糖酶的發(fā)酵液；其特征在于包括如下步驟：

A、殼聚糖酶生產(chǎn)菌種選用拉丁文名稱為Escherichia coli，保藏編號(hào)為CGMCCNo.19765的埃希氏大腸桿菌；

B、調(diào)節(jié)接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH＝6.8～7.2，于溫度為35℃～37℃的條件下進(jìn)行通氣發(fā)酵；發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)流加氨水控制pH＝6.8～7.2，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量百分濃度＜0.5％時(shí)，流加補(bǔ)入葡萄糖溶液；

C、當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的OD₆₀₀≥30時(shí)，加入濃度為0.1mmol/L～0.5mmol/L誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)培養(yǎng)，同時(shí)將發(fā)酵溫度降至30℃-33℃；當(dāng)發(fā)酵液中酶活不再增長(zhǎng)或發(fā)酵周期≤30小時(shí)發(fā)酵結(jié)束制成含有殼聚糖酶的發(fā)酵液；

D、將步驟C中制備的含有殼聚糖酶的發(fā)酵液經(jīng)高壓均質(zhì)、離心得到含有殼聚糖酶的粗酶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于步驟A中的發(fā)酵培養(yǎng)基采用如下原料組成：

葡萄糖3.0％～4.0％；酵母粉2.0％～3.0％；蛋白胨1.0％～1.5％；氯化鈉0.8％～1.5％；磷酸氫二鉀0.5％～1.5％；磷酸二氫鉀0.15％～0.3％；七水硫酸鎂0.1％～0.5％；有機(jī)硅消泡劑0.05％～0.15％；余量為無(wú)菌水。

4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于步驟B中流加的葡萄糖溶液的質(zhì)量百分濃度為0.3％～0.6％。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于步驟B中通氣條件為通風(fēng)量0.3vvm～0.7vvm，氨水的質(zhì)量百分比濃度為25％～28％。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于步驟D中高壓均質(zhì)的條件是壓力為45Mpa～65Mpa。

7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于還包括有一步驟E，該步驟的工藝條件如下：

E、將步驟D中制備的含有殼聚糖酶的粗酶液通過(guò)微濾、超濾進(jìn)行濃縮，以醇沉收集沉淀，得濕固酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于步驟E的工藝條件是：將步驟D制備的粗酶液通過(guò)0.1微米的微濾膜除雜，然后通過(guò)4000Dalton超濾進(jìn)行濃縮，濃縮至原液的1/8～1/5，以體積百分比濃度90％～95％乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀，在6000-10000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心收集沉淀，得濕固酶。

9.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于還包括有一步驟F，該步驟的工藝條件如下：

F、將步驟E中制備的濕固酶進(jìn)行低溫真空干燥、低溫粉碎后制成粉體高純度殼聚糖酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于步驟F的工藝條件是：將步驟E中制成的濕固酶在溫度為40℃～50℃條件下真空干燥，將干燥后的物料在溫度不超過(guò)50℃的條件下粉碎制成粉體高純度殼聚糖酶，純化后的粉體高純度殼聚糖酶酶活可達(dá)63000U/g。

11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有高活性的殼聚糖酶的制備方法，其特征在于還包括一菌種活化步驟，是將殼聚糖酶生產(chǎn)菌種接種到LB培養(yǎng)基中，在溫度為35-37℃、轉(zhuǎn)速為170-200轉(zhuǎn)/分鐘條件下活化10～16小時(shí)。