[發(fā)明專利]一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011029036.4 | 申請日： | 2020-09-27 |
| 公開（公告）號： | CN112226424A | 公開（公告）日： | 2021-01-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 謝志偉;楊小麗;吳畏;白彩虹;嚴俊 | 申請（專利權(quán)）人： | 蘇州新格諾康生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/48 | 分類號： | C12N9/48;G01N33/569;G01N33/573;G01N33/68 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 215024 江蘇省蘇州市工*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 治療 covid 19 ace2 fc 融合 蛋白 功能 測試 方法 | ||
本發(fā)明提供了一種用于治療COVID?19的ACE2?Fc融合蛋白功能測試方法，具體包括以下內(nèi)容：表達人野生型ACE2?Fc融合蛋白：克隆了人野生型ACE的細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的DNA序列；將ACE2的ECD與人IgG1的Fc部分融合，延長可溶性ACE2的半衰期；將ACE2?Fc融合蛋白在CHO細胞中進行表達，并使用蛋白A/G瓊脂糖來純化細胞培養(yǎng)上清液中的ACE2?Fc融合蛋白；優(yōu)化表達系統(tǒng)。該發(fā)明有效的證明了ACE2?Fc融合蛋白可將阻止或阻止病毒進入細胞，減慢感染的進程，并使病毒暴露于細胞外，以被人類免疫系統(tǒng)識別和消除。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法。
背景技術(shù)
冠狀病毒首先通過蛋白刺突與宿主細胞表面的靶受體結(jié)合，與細胞膜融合后病毒核衣殼進入細胞內(nèi)進行后續(xù)復(fù)制。在SARS-CoV病例中，病毒粒子表面的S蛋白介導(dǎo)受體識別和膜融合。在病毒感染過程中，三聚體S蛋白被裂解成S1和S2亞基，S1亞基在向融合后構(gòu)象轉(zhuǎn)變的過程中被釋放。S1包含受體結(jié)合域(RBD)，后者直接與ACE2的肽酶域(PD)結(jié)合，而S2負責(zé)膜融合。鑒于SARS-CoV-2和SARS-CoV之間的高度序列同源性(70-80％)，最近有研究表明SARS-CoV-2蛋白的胞外域與ACE2的PD結(jié)合，其解離常數(shù)(Kd)約為15nM。因此，針對SARS-CoV-2表面的S蛋白或宿主細胞上的ACE2是開發(fā)COVID-19生物制劑時需要考慮的重點。雖然中和抗體是一個非常有吸引力的選擇，但開發(fā)針對S蛋白或ACE2的人源化抗體，使其具有足夠高的親和力和特異性來中和病毒可能需要數(shù)月甚至更長時間。而可溶性ACE2的開發(fā)是最為迅速和最有前途的策略之一，它可以與SARS-CoV-2高親和度和高特異性結(jié)合，從而阻止病毒進入宿主細胞。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法，以解決上述背景技術(shù)中的存在的問題。
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法，具體包括以下內(nèi)容：
步驟1、表達人野生型ACE2-Fc融合蛋白：
(1)克隆了人野生型ACE的細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的DNA序列；
(2)將ACE2的ECD與人IgG1的Fc部分融合，延長可溶性ACE2的半衰期；
(3)將ACE2-Fc融合蛋白在CHO細胞中進行表達，并使用蛋白A/G瓊脂糖來純化細胞培養(yǎng)上清液中的ACE2-Fc融合蛋白；
步驟2、體外測試ACE2-Fc融合蛋白對SARS-CoV-2 S1/RBD蛋白的結(jié)合功能和抑制功能：
(4)用10ug/ml的SARS-CoV-2RBD-His融合蛋白包被96孔板，再使用ACE2-Fc融合蛋白從5ug/ml開始以2倍系列稀釋液進行滴定；
(5)記錄滴定實驗所得測試數(shù)據(jù)，并通過曲線擬合，用于計算EC50，從而通過ELISA來評估CHO細胞表達的ACE2-Fc融合蛋白與SARS-CoV-2 S1/RBD蛋白之間的結(jié)合親和力；
(6)用10ug/ml的ACE2-Fc融合蛋白包被96孔板，ACE2-Fc融合蛋白在稀釋液中滴定；將滴定數(shù)據(jù)進行曲線擬合，驗證ACE2-Fc融合蛋白對S1/RBD-His與固定的ACE2蛋白結(jié)合的抑制活性；
步驟3、優(yōu)化表達系統(tǒng)：
(7)對比大腸桿菌，酵母，植物和哺乳動物細胞(CHO細胞)在內(nèi)的幾種表達系統(tǒng)中測試了人ACE2-Fc蛋白的表達，選擇酵母作為優(yōu)化表達系統(tǒng)；
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