[發(fā)明專利]一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011029036.4
• 申請日: 2020-09-27
• 公開（公告）號: CN112226424A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝志偉;楊小麗;吳畏;白彩虹;嚴(yán)俊
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州新格諾康生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;G01N33/569;G01N33/573;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法，其特征在于：具體包括以下內(nèi)容，

步驟1、表達(dá)人野生型ACE2-Fc融合蛋白：

(1)克隆了人野生型ACE的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的DNA序列；

(2)將ACE2的ECD與人IgG1的Fc部分融合，延長可溶性ACE2的半衰期；

(3)將ACE2-Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并使用蛋白A/G瓊脂糖來純化細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ACE2-Fc融合蛋白；

步驟2、體外測試ACE2-Fc融合蛋白對SARS-CoV-2S1/RBD蛋白的結(jié)合功能和抑制功能：

(4)用10ug/ml的SARS-CoV-2RBD-His融合蛋白包被96孔板，再使用ACE2-Fc融合蛋白從5ug/ml開始以2倍系列稀釋液進(jìn)行滴定；

(5)記錄滴定實驗所得測試數(shù)據(jù)，并通過曲線擬合，用于計算EC50，從而通過ELISA來評估CHO細(xì)胞表達(dá)的ACE2-Fc融合蛋白與SARS-CoV-2S1/RBD蛋白之間的結(jié)合親和力；

(6)用10ug/ml的ACE2-Fc融合蛋白包被96孔板，ACE2-Fc融合蛋白在稀釋液中滴定；將滴定數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，驗證ACE2-Fc融合蛋白對S1/RBD-His與固定的ACE2蛋白結(jié)合的抑制活性；

步驟3、優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)：

(7)對比大腸桿菌，酵母，植物和哺乳動物細(xì)胞(CHO細(xì)胞)在內(nèi)的幾種表達(dá)系統(tǒng)中測試了人ACE2-Fc蛋白的表達(dá)，選擇酵母作為優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)；

(8)將ACE2-Fc融合蛋白在酵母和CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并使用蛋白A/G瓊脂糖來純化細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ACE2-Fc融合蛋白；

(9)用10ug/ml的SARS-CoV-2RBD-His融合蛋白包被96孔板，使用ACE2-Fc融合蛋白從5ug/ml開始以2倍系列稀釋液進(jìn)行滴定；

(10)記錄滴定實驗所得測試數(shù)據(jù)，并通過曲線擬合，用于計算EC50，從而測試從酵母和CHO細(xì)胞純化的ACE2-Fc融合蛋白與SARS-CoV-2S1/RBD蛋白之間的結(jié)合親和力；

(11)從222.5nM開始，以5倍系列稀釋度滴定CHO和酵母的ACE2-Fc融合蛋白，將來自SARS-CoV-2的RBD-His蛋白與滴定的ACE2-Fc進(jìn)行孵育，然后添加到ACE2過表達(dá)的CHO細(xì)胞中；

(12)測量每個熒光峰的平均熒光單位(MFU)，并針對CHO和酵母表達(dá)的ACE2-Fc濃度作圖；對CHO和酵母表達(dá)的ACE2-Fc的競爭結(jié)合的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行最佳擬合，并用于計算IC50，用于驗證CHO和酵母表達(dá)系統(tǒng)中ACE2-Fc蛋白的體外抑制作用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法，其特征在于：所述(6)中的稀釋液為2倍系列稀釋液，且ACE2-Fc融合蛋起始濃度為5ug/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于治療COVID-19的ACE2-Fc融合蛋白功能測試方法，其特征在于：所述(11)中將來自SARS-CoV-2的RBD-His蛋白與滴定的ACE2-Fc孵育0.5小時。