[發(fā)明專利]一種制備C14脂肪酸的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011026131.9
• 申請(qǐng)日: 2020-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112063645A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡永紅;趙昕;程夢(mèng);楊文革;章泳;李寶聚;謝寧昌;曹洋;周彬;米莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/66;C12N15/52;C12N15/55;C12P7/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

本發(fā)明公開(kāi)了一種制備C14脂肪酸的方法。通過(guò)構(gòu)建含有共同表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的重組表達(dá)載體的工程大腸桿菌中而獲得。本發(fā)明所提供的高效產(chǎn)C14脂肪酸工程大腸桿菌是BL21(DE3)。該合成路徑條件溫和，產(chǎn)物專一性好，避免了傳統(tǒng)的化學(xué)合成途徑中苛刻的反應(yīng)條件，同時(shí)不需要貴金屬催化劑，有效的降低了生產(chǎn)成本，該方法為昆蟲(chóng)性信息素的生物合成的工業(yè)化應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備C14脂肪酸的方法，可作為生產(chǎn)斜紋夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期材料，以指導(dǎo)斜紋夜蛾性信息素的生物合成技術(shù)研究，提高田間防治效率，減少化學(xué)農(nóng)藥使用，保護(hù)環(huán)境，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)收益。

技術(shù)背景

長(zhǎng)期以來(lái)，農(nóng)藥特別是化學(xué)農(nóng)藥一直是斜紋夜蛾防治的主要手段。傳統(tǒng)農(nóng)用化學(xué)品帶來(lái)的問(wèn)題日益突出，易產(chǎn)生抗藥性，難以降解并累積毒性甚至產(chǎn)生致癌性，影響農(nóng)業(yè)生態(tài)安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、人體健康。

昆蟲(chóng)性信息素防治方法具有較強(qiáng)的特異性、靈敏度高、無(wú)污染、安全性高等優(yōu)勢(shì)。到目前為止，昆蟲(chóng)性信息素都是通過(guò)化學(xué)方法合成的，其反應(yīng)條件苛刻(無(wú)水無(wú)氧反應(yīng))，催化劑和有機(jī)金屬試劑昂貴，工藝路線長(zhǎng)大規(guī)模生產(chǎn)難，穩(wěn)定性差，直接限制了昆蟲(chóng)性信息素的工業(yè)化生產(chǎn)。目前通過(guò)研究基因工程技術(shù)、微生物法發(fā)酵、體外酶催化合成生產(chǎn)性信息素的方法微乎其微。

C：14脂肪酸是生物法合成斜紋夜蛾性信息素(Z,E)-9-11-十四碳二烯-1-醇乙酸酯和(Z,E)-9-12-十四碳二烯-1-醇乙酸酯的前期原料，然而來(lái)自植物和其他微生物生產(chǎn)宿主的脂肪酸的生物生產(chǎn),在很大程度上依賴于操縱嚴(yán)格調(diào)節(jié)的脂肪酸生物合成途徑，并且合成的脂肪酸是不同鏈長(zhǎng)(C6-C24)的脂肪酸混雜在一起，C：14脂肪酸含量較低，較難分離。

本發(fā)明立足于江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目，通過(guò)構(gòu)建工程大腸桿菌的方法生產(chǎn)C：14脂肪酸，通過(guò)在關(guān)鍵技術(shù)上的創(chuàng)新，實(shí)現(xiàn)卡脖子技術(shù)的突破。本發(fā)明可減少傳統(tǒng)農(nóng)用化學(xué)品使用，保護(hù)環(huán)境，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)收益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種制備C14脂肪酸的方法，為斜紋夜蛾性信息素的生物合成技術(shù)提供一種必不可少的前期原料，可改善其化學(xué)合成法帶來(lái)的大量問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種制備C14脂肪酸的方法，其具體步驟為：

(1)提取并克隆乙酰輔酶A羧化酶基因accA與硫脂酶基因yneP；

(2)將克隆的accA基因與載體用相同的酶切方法進(jìn)行酶切，yneP基因與載體用相同的酶切方法進(jìn)行酶切，將載體與基因片段按一定的比例連接，獲得重組載體pET-accA與pET-TE；

(3)將構(gòu)建好的重組載體pET-TE熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序篩選獲得陽(yáng)性重組工程菌；

(4)再將pET-accA重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)入一個(gè)含有pET-TE的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，即獲得了含有乙酰輔酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大腸桿菌；冷凍保存該菌株；

(5)挑取構(gòu)建好的重組大腸桿菌單菌落，接種至含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6時(shí)，再加入誘導(dǎo)劑至其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.8-1mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)8-24小時(shí)，培養(yǎng)液在8000—10000rpm條件下，離心5—10分鐘，取培養(yǎng)液上清液；

(6)發(fā)酵培養(yǎng)上清液，萃取，減壓濃縮，收集分析產(chǎn)物。

優(yōu)選步驟(1)中所述accA基因來(lái)源于乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)基因組DNA，Genbank登錄號(hào)為：2878570的序列。yneP基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌ATCC23857基因組DNA，Genbank登錄號(hào)為：2914242的序列。