[發(fā)明專利]一種制備C14脂肪酸的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011026131.9
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112063645A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡永紅;趙昕;程夢;楊文革;章泳;李寶聚;謝寧昌;曹洋;周彬;米莉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/52;C12N15/55;C12P7/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

1.一種制備C14脂肪酸的方法，其具體步驟為：

(1)提取并克隆乙酰輔酶A羧化酶基因accA與硫脂酶基因yneP；

(2)將克隆的accA基因與載體用相同的酶切方法進行酶切，yneP基因與載體用相同的酶切方法進行酶切，將載體與基因片段按一定的比例連接，獲得重組載體pET-accA與pET-TE；

(3)將構(gòu)建好的重組載體pET-TE熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測序篩選獲得陽性重組工程菌；

(4)再將pET-accA重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)入一個含有pET-TE的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，即獲得了含有乙酰輔酶A羧化酶基因和硫脂酶基因的工程大腸桿菌；冷凍保存該菌株；

(5)挑取構(gòu)建好的重組大腸桿菌單菌落，接種至含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)并誘導表達目的蛋白，培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時，再加入誘導劑至其在培養(yǎng)基中的終濃度為0.8～1mmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)8-24小時，培養(yǎng)液在8000～10000rpm條件下，離心5—10分鐘，取培養(yǎng)液上清液；

(6)發(fā)酵培養(yǎng)上清液，萃取，減壓濃縮，收集分析產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)中所述的accA基因與載體的酶切方法為NcoI/BamHI雙酶切，yneP基因與載體的酶切方法為NdeI/NotI雙酶切。所述的載體為pET-30a或pQE80L，載體與基因片段按摩爾比為1∶(5～10)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)與步驟(4)中所述的熱擊轉(zhuǎn)化溫度均為35～45℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)中所述的冷凍保存溫度為-80℃～-90℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(5)中所述的菌體的體積接種量為0.5～1.5％；含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中的抗生素為卡那霉素或氨芐青霉素；含有抗生素的LB培養(yǎng)基中的抗生素濃度為30～50μg·mL^-1。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(5)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)并誘導表達目的蛋白的培養(yǎng)條件、加入誘導劑后繼續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件和步驟(6)的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：溫度35～37℃，轉(zhuǎn)速200～250rpm，pH6.5～7.5；步驟(6)中發(fā)酵培養(yǎng)上清液的時間為1.5～2.5小時。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(5)中所述的誘導劑為IPTG。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(6)中所述的萃取劑為氯仿和甲醇的混合液或正己烷，其中氯仿和甲醇的體積比為(3～4):2；發(fā)酵液和萃取劑的體積比為1∶(2～4)。