[發明專利]用于生產吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 202011024021.9
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112111440B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 劉開泉;王瑞明;李玲;王騰飛;李丕武
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12P17/12;C12R1/38
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 宋海海

本發明提供一株用于生產吩嗪?1?甲酰胺的基因工程菌及其制備方法和用途，屬于基因工程技術領域。本發明是以綠針假單胞菌Qlu?1為出發菌株，通過基因工程技術從Qlu?1菌株基因組中phzO基因替換為外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因，同時導入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，并敲除pykF基因，通過構建相應基因工程菌株，使得吩嗪?1?甲酰胺的產量大幅提高。其中，基因工程菌株QPCN?8具有最佳效果，其PCN產量高達10378.5mg/L，同時生長性能良好，因此具有良好的實際應用之價值。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及用于生產吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制備方法和用途。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

吩嗪衍生物是一類含氮雜環化合物，通常顏色各異，以橙色或黃色為主，也有綠色、紅色等，側鏈取代基的不同決定了吩嗪顏色的不同，而結構上的差異同時決定了各自不同的物理屬性以及抑制病原菌的生物活性。目前自然界已經發現了多種具有相似基本結構的吩嗪類化合物，有些產吩嗪的菌株能同時產生好幾種不同的吩嗪衍生物，而幾乎所有的吩嗪化合物對細菌和真菌都有生物活性。假單胞菌產生的吩嗪類抗生素包括綠膿菌素(pyocyanin，PYO)和吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilic acid,PCA)、1-羥基吩嗪(1-hydroxyphenazine，1-OH-PHZ)、2-羥基吩嗪(2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ)等。其中，PCN不僅具有良好的生防功能，同時還具有抗腫瘤等生物醫藥功能，有比較好的應用前景。

目前，吩嗪-1-甲酰胺生產方法雖有化工方法，但條件苛刻，并且向環境釋放有毒有害物質，所以主要由假單胞菌中的銅綠假單胞菌生產，但發明人發現，銅綠假單胞菌則是目前醫院中一種比較常見的機會致病菌，并不太適合作為生產菌株來推廣應用。

發明內容

為了克服上述技術問題，本發明提供用于生產吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制備方法和用途。本發明以相對安全的綠針假單胞菌為出發菌株，通過基因工程技術在其基因組上敲除具有負調控作用的雙元調控相關基因，并通過增強莽草酸的利用提高PCN產量，最終制備得到的基因工程菌其PCN產量高達10378.5mg/L，具有良好的實際應用之價值。

為實現上述技術目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明的第一個方面，提供一株用于生產吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌，具體是將綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因組中的phzO基因替換為外源的phzH基因，并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因；然后導入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，敲除pykF基因即得。

其中，所述綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1是一株篩選自中國濰坊蔬菜大棚菜椒根際的綠針假單胞菌，經測序得知含有phzABCDEFG基因簇，以及吩嗪類的修飾基因phzO，可以產生吩嗪-1-羧酸以及2-羥基吩嗪。該菌株已送至中國典型培養物保藏中心(地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學)，保藏日期為2020年05月08日，保藏編號為CCTCC NO：M 2020108。

本發明的第二個方面，提供上述高產吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制備方法，所述方法包括：