[發(fā)明專利]16S rRNA基因序列分析鑒定臨床疑難菌種的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011021614.X
• 申請(qǐng)日: 2020-09-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112063702A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 浦江;褚少朋;湯自潔;錢(qián)晨;李嫻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 南通毅帆知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32386
• 代理人: 任毅

1.一種鑒定臨床疑難菌種的方法，其特征在于，采用16S rRNA基因序列分析方法，包括：

S1：抽提待鑒定菌種的細(xì)菌DNA，選擇細(xì)菌通用引物，建立擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的PCR方法；

S2：優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

S3：將擴(kuò)增產(chǎn)物與基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，得到待鑒定細(xì)菌的菌種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌通用引物為27F和1492R通用引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系包括引物、Pfu Buffer、dNTP、 Pfu DNA 聚合酶、DNA 模板和ddH₂O。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物濃度為0.1-0.75μM/L；優(yōu)選的，引物濃度為0.5μM/L。

5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述Pfu DNA 聚合酶的用量為2.5-7.0U/體系；優(yōu)選的，所述Pfu DNA 聚合酶的用量為5.0 U/體系。

6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為：95°C 預(yù)變性 5min, 而后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95℃ 變性 30s，52-55℃ 退火10-40s，72℃ 延伸 90s），隨后 72℃ 延伸 7 min。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR退火溫度為52℃；優(yōu)選的，退火時(shí)間為30s。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在S3中，采用Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，得到待鑒定細(xì)菌的菌種。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌包括霍氏鮑特菌、馬爾他布魯菌和空腸彎曲菌。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的方法在鑒定樣本中微生物種類的應(yīng)用。