[發明專利]16S rRNA基因序列分析鑒定臨床疑難菌種的方法

在審

• 申請號: 202011021614.X
• 申請日: 2020-09-25
• 公開（公告）號: CN112063702A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發明（設計）人: 浦江;褚少朋;湯自潔;錢晨;李嫻
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 南通毅帆知識產權代理事務所(普通合伙) 32386
• 代理人: 任毅

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種16S rRNA基因序列分析鑒定臨床疑難菌種的方法。該鑒定臨床疑難菌種的方法，采用16S rRNA基因序列分析方法，包括：S1：抽提待鑒定菌種的細菌DNA，選擇細菌通用引物，建立擴增細菌16S rRNA的PCR方法；S2：優化PCR反應體系和反應條件得到擴增產物；S3：將擴增產物與基因數據庫進行序列比對，得到待鑒定細菌的菌種。本發明運用16S rRNA基因序列分析技術，建立了一種新的有效地鑒定疑難菌種的方法，擴大了對臨床菌種的鑒定譜，滿足臨床對疑難菌種的鑒定需求。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種16S rRNA基因序列分析鑒定臨床疑難菌種的方法。

背景技術

16S rRNA基因序列分析是指通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得樣本中微生物的16S rRNA序列信息，再與16S rRNA數據庫進行比對，從而對樣本中的微生物進行種屬鑒定及進化樹分析，是一種快速有效的方法。16S rRNA存在于所有的生物中，其進化具有良好的時鐘性質，在結構與功能上高度保守，被稱為細菌化石，故16S rRNA是細菌種屬鑒定及系統分類研究中最常用的分子鐘^[1-2]。

生物細胞內，核糖體RNA(rRNA)與幾十種蛋白質結合形成核糖體，繼而沿著mRNA模板移動，執行著蛋白質合成的功能，其在種系發生中發揮著不可或缺的作用。在漫長的進化過程中，rRNA分子功能幾乎保持恒定,某些部位分子排列順序變化極其緩慢,形成“細菌化石”^[7-9]。通過對恒定序列的測定，可揭示物種的親緣關系，為系統發育提供線索；rRNA 同時具有高變性，通過對生物物種的特征性核酸序列的測定,可進行屬種鑒定。細菌核糖體RNA(rRNA)按照沉降系數分類，分別有5S、16S及23S rRNA三種。16S rRNA為細胞所共有，在細菌RNA含量中占比大，分子量適中約1.5KB，其既能體現不同菌屬之間的差異，又可通過測序技術較易獲得序列，故16S rRNA基因序列作為生物系統發育及鑒定指標最為合適^[10-11]。對于臨床上用常規方法尚不能鑒別的細菌，Drancouurt等眾多學者采用16S rRNA基因序列分析技術，均解開了謎題^{[1-2,7,10-12]}。16S rRNA基因序列分析技術在疑難菌種的鑒定中有著重要的臨床應用價值^[13-15]。

目前，全球微生物感染呈現快速上升的趨勢，細菌耐藥率不斷增高，新發感染病原微生物層出不窮，對臨床微生物檢驗提出了更高的需求。臨床微生物實驗室需根據自身條件建立有效而可信的能鑒別各種細菌的方法，該法需速度快、敏感性、特異性高，且易于操作。傳統的細菌鑒定主要依據形態和生理性狀，需要進行培養及生化試驗或免疫學檢測。隨著微生物學技術的發展，目前全自動細菌鑒定儀已基本替代手工方法，操作方便，鑒定范圍超過98％的臨床常見菌株，基本能夠滿足臨床實驗室對細菌鑒定的初步需求。然而亦可能存在如下問題：所依賴的表型表達不穩定；敏感度不高，某些方法只適用于單一菌種；某些方法的應用還受到血清變種的影響^[3-6]。因此，對某些疑難罕見菌種，全自動細菌鑒定儀并不能給出理想的鑒定結果。因此，亟需建立了一種新的有效地鑒定疑難菌種的方法，并對其進行臨床應用評價，滿足臨床對疑難菌種的鑒定需求。

發明內容

本發明的目的在于運用16S rRNA基因序列分析技術，建立一種有效地鑒定疑難菌種的 PCR方法，并對其反應體系及條件進行優化，將其應用于臨床疑難菌種的鑒定。

具體的，本發明的技術方案如下：

本發明第一個方面公開了一種鑒定臨床疑難菌種的方法，確切來講，采用16SrRNA基因序列分析方法，包括：

S1：抽提待鑒定菌種的細菌DNA，選擇細菌通用引物，建立擴增細菌16S rRNA的PCR方法；

S2：優化PCR反應體系和反應條件得到擴增產物；