[發(fā)明專利]BMSC-Exo對高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷保護(hù)機制的研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011018866.7
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN112111459A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳春鈴;趙貴芳;王芝川;葛正鑫;李順康;鄒平;黃珀;陳蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 西南醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/6841;G01N1/30;G01N33/68;A61K49/00
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 汪麗麗

本發(fā)明公開的屬于糖尿病腎病治療技術(shù)領(lǐng)域，具體為BMSC?Exo對高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷保護(hù)機制的研究方法，該BMSC?Exo對高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷的保護(hù)機制的實驗步驟包括HK2細(xì)胞的分組與處理、Crispr/Cas9技術(shù)構(gòu)建miR?886?5p敲除的HK2細(xì)胞系、RNA pull down技術(shù)、FISH實驗、DN的建立和PAS糖原染色，通過生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合熒光素酶報告載體實驗證明miR?886?5p與靶基因相互作用，通過RNA pull down實驗和FISH實驗進(jìn)一步證明miR?886?5p與靶基因結(jié)合的關(guān)系，通過Rescue實驗證明靶基因能夠逆轉(zhuǎn)miR?886?5p的功能，確認(rèn)miR?886?5p在HK2細(xì)胞中發(fā)揮作用的機制。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糖尿病腎病治療技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種BMSC-Exo對高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷保護(hù)機制的研究方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞焦亡是糖尿病腎病(DN)腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷的重要影響因素。實驗發(fā)現(xiàn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(BMSC-exo)能夠抑制體外高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞(HK2)焦亡。通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)microRNA-886-5p(miR-886-5p)在加入BMSC-exo后的HK2細(xì)胞中顯著上調(diào)，提示miR-886-5p可能參與了DN的發(fā)生。因此，本研究將探索BMSC-Exo對高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞損傷的保護(hù)機制，重點闡明miR-886-5p對高糖所導(dǎo)致的HK2細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)的抑制作用及其相應(yīng)的信號通路，為DN的治療提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。

糖尿病腎病(DiabeticNephropathy，DN)作為糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。在我國成年人的糖尿病患病率約為10.9％，而其中DN的患病率為33.6％，DN患者與單純糖尿病患者比較死亡風(fēng)險增加1倍，較正常人群死亡風(fēng)險增加3倍。DN作為一種重大慢性疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康，它的治療已經(jīng)成為全球性難題。

DN的病理改變主要包括腎小球、腎小管、腎間質(zhì)以及腎血管的病變。長期以來認(rèn)為DN主要是腎小球病變，而其他病變是腎小球病變的繼發(fā)改變。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)腎小管病變在DN的早期就可獨立于腎小球病變出現(xiàn)，并與DN預(yù)后密切相關(guān)。腎小管間質(zhì)損傷病變是DN進(jìn)展過程中的獨立危險因素甚至是始動因素，可能比腎小球能更好的預(yù)測DN嚴(yán)重程度及腎功能，研究并深入了解DN的發(fā)病機制，以及腎小管病變DN中發(fā)揮的作用，對于尋求新的潛在治療靶點意義重大。

腎臟細(xì)胞損傷包括壞死、凋亡、焦亡等細(xì)胞死亡形式，是導(dǎo)致DN腎小球和腎小管密度、數(shù)量減少以及腎功能衰竭的主要原因。焦亡屬于細(xì)胞程序性死亡的一種，是指細(xì)胞接受某種信號或者受到某些因素刺激后，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而發(fā)生的一種主動消亡過程。細(xì)胞焦亡在機制上不同于其他類型的程序性細(xì)胞死亡形式。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡是由炎癥性半胱天冬酶-1/4/5/11(caspase-1/4/5/11)介導(dǎo)的，多種因素觸發(fā)的死亡形式。病原微生物來源的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)可以被宿主細(xì)胞的模式識別受體(PRRs)識別，進(jìn)而促使炎癥小體的組裝，招募活化caspase-1，而caspase-4/5/11可通過炎癥小體的非經(jīng)典激活途徑活化。活化后的caspase-1/4/5/11切割共同底物GasderminD(GSDMD)，生成具有質(zhì)膜成孔活性的N-末端片段并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上寡聚打孔，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，誘發(fā)宿主細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡能夠引起促炎性細(xì)胞內(nèi)含物的釋放，然后招募大量的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，引發(fā)局部炎癥，釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)吸引更多的免疫細(xì)胞并增強炎癥反應(yīng)。因此，2型糖尿病、心肌炎、內(nèi)毒素性休克、缺血性腦病以及糖尿病腎病等多種疾病均存在細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)的病理特性。越來越多的證據(jù)表明：細(xì)胞焦亡在DN發(fā)病機制中起著重要作用。在2型糖尿病慢性炎癥進(jìn)展中，炎性因子IL-1β可以介導(dǎo)胰島β細(xì)胞焦亡發(fā)生。通過檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠模型NLRP3、Caspase-1、IL-1β等焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著升高，由此揭示了NLRP3炎性分子介導(dǎo)的炎癥損傷在DN中的作用。Fu等通過觀察高糖條件下人腎小球系膜細(xì)胞和不同年齡糖尿病腎病大鼠中NLRP3相關(guān)蛋白的表達(dá)，得出NLRP3和高糖激活可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與DN的發(fā)生、發(fā)展的結(jié)論。