[發明專利]BMSC-Exo對高糖誘導HK2細胞損傷保護機制的研究方法

在審

• 申請號: 202011018866.7
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN112111459A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 吳春鈴;趙貴芳;王芝川;葛正鑫;李順康;鄒平;黃珀;陳蓉
• 申請（專利權）人: 西南醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12Q1/6841;G01N1/30;G01N33/68;A61K49/00
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 汪麗麗

1.BMSC-Exo對高糖誘導HK2細胞損傷保護機制的研究方法，其特征在于：該BMSC-Exo對高糖誘導HK2細胞損傷的保護機制的實驗步驟如下：

步驟一：HK2細胞的分組與處理；

A：將HK2細胞分為一般實驗組和轉染實驗組，一般實驗組包括正常對照組、高糖組、高滲透壓對照組，轉染實驗組包括正常對照組、高糖組、陰性對照組和干擾組；

B:將一般實驗組中正常對照組的HK2細胞放入5.5mM葡萄糖培養液中進行培養，將一般實驗組中高糖組的HK2細胞放入25mM葡萄糖培養液中進行培養，將一般實驗組中高滲透壓對照組的HK2細胞放入5.5mM葡萄糖+19.5mM Mannitol培養液中進行培養，并收集一般實驗組中產生的蛋白質、RNA以及細胞培養上清備用；

C:將轉染實驗組中正常對照組的HK2細胞放入5.5mM葡萄糖培養液中進行培養，將轉染實驗組中高糖組的HK2細胞放入25mM葡萄糖培養液中進行培養，將轉染實驗組中陰性對照組的HK2細胞放入100nM的anti-miR-NC+5.5mM葡萄糖培養液中進行培養，將轉染實驗組中干擾組的HK2細胞放100nM的anti-miR-886-5p+25mM葡萄糖培養液中進行培養，同時利用lipofectin3000試劑盒對轉染實驗組中的HK2細胞進行轉染；

步驟二：Crispr/Cas9技術構建miR-886-5p敲除的HK2細胞系；

A:從NCBI數據庫中查詢pri-miR-886-5p的序列，在外顯子中確定待敲除的序列，選擇23-250bp的外顯子序列輸入軟件中，進行特異sgRNA設計，根據輸出的sgRNA模板序列，合成一對序列互補的DNA Oligos；

B:將合成的Oligos以逐步降溫的方法退火成雙鏈，然后與Cas9質粒進行連接，轉化DH5α感受態大腸桿菌細胞，涂板，陽性克隆測序，正確的陽性克隆，小抽后獲得含shRNA表達元件的Cas9質粒，錯配酶法檢測剪切活性，靶序列PCR擴增后經變性、退火，將形成錯配；

C:錯配酶將識別錯配的雜合雙鏈并剪切；

D:產物跑電泳，比較切割條帶與未切割條帶的比例，判斷Cas/sgRNA的活性；

步驟三：RNA pull down技術；

A:加入50μl鏈霉親和素磁珠到1.5ml的EP管，放入磁力架，吸去液體；

B:加入50μl pH7.520mM Tris重懸磁珠；

C:重復步驟三中的A-B，吸去液體；

D:加入50μl 1×RNA Capture Buffer重懸磁珠，加入50pmol RNA探針到磁珠中，混勻，室溫孵育30min；

E:加入50μl鏈霉親和素磁珠到1.5ml的EP管，吸去液體，加入50μl pH7.520mM Tris重懸磁珠，吸去液體，加入100μl 1×Protein-RNA Binding Buffer到磁珠，混勻，加入100μlMaster Mix，混勻，4℃孵育60min，吸去液體，加入100μl 1×wash buffer，混勻，將EP管放入磁力架，吸去液體；

F:重復步驟三中的A-B；

G:加入50μl Elution buffer，混勻，37℃孵育30min，將EP管放入磁力架，收集液體，-20℃保存；

步驟四：FISH實驗；

A:細胞爬片后，室溫固定20分鐘，在切片上滴加3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃或室溫消化120秒鐘；

B:0.5M PBS洗3次×5分鐘，蒸餾水洗1次；

C:每張切片加20μl預雜交液，37℃孵育4小時預雜交，用雜交液稀釋地高辛標記的寡核苷酸探針，按每張切片加20μl雜交液，37℃雜交過夜；

D:雜交后洗滌，滴加封閉液，37℃孵育30分鐘，甩去多余液體，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃室溫120分鐘，0.5M PBS洗5分鐘×4次；

E:取1ul SABC-FITC加原位雜交用PBS 100ul，每張切片加50ul 37℃30分鐘；

F:用水溶性封片劑或抗熒光衰減封片劑封片后，熒光顯微鏡觀察，陽性細胞的胞漿或胞核著色呈黃綠色熒光；

步驟五：DN的建立；

A:適應性飼養SD大鼠一周，造模前禁食不禁水12小時，隨機挑選30只SD大鼠準備造模，并將30只SD大鼠分為實驗組20只SD大鼠和正常對照組10只SD大鼠；

B:臨時配制1％STZ溶液，按65mg/kg腹腔注射到20只SD大鼠的腹腔內，另外10只大鼠注射等體積的檸檬酸緩沖液，作為正常對照組；

C:STZ溶液腹腔注射72小時后，連續3天檢測SD大鼠的隨機血糖，當隨機血糖均16.7mmol/L，24h尿量增加1倍，即1型糖尿病模型造模成功，然后對造模成功的SD大鼠的腎組織以及血液、尿液進行檢測，并選取腎病模型建立成功的SD大鼠；

步驟六：PAS糖原染色；

A:切片脫蠟，依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-無水乙醇Ⅰ-無水乙醇Ⅱ-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，然后蒸餾水浸泡2min；

B:過碘酸水溶液氧化10min；

C:蒸餾水重復洗滌；

D:Schiff試劑染30min；

E:流水洗10min，顯出紅色為止；

F:蘇木精復染5min水洗；

G:95％乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察并照相；

H:PAS染色結果判定：細胞核呈藍色，腎小球系膜基質、淀粉樣物質、纖維蛋白均呈紫紅色；

I:計算系膜增生面積：Image-Pro Plus軟件計算各組每只大鼠的紫紅色的系膜基質增生區域面積。