[發(fā)明專利]一種腺苷酸環(huán)化酶制備環(huán)磷酸腺苷的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011015223.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-24
• 公開（公告）號(hào): CN112063670A
• 公開（公告）日: 2020-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉燕;李恒;王宏;傅得響;張燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州美亞藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/32
• 分類號(hào): C12P19/32;C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70
• 代理公司: 北京天盾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421
• 代理人: 張彩珍

本方案公開了一種腺苷酸環(huán)化酶制備環(huán)磷酸腺苷的方法，該方法包括：以腺苷酸環(huán)化酶為催化劑，以三磷酸腺苷為底物，在Mg²⁺的存在下，獲得含有環(huán)磷酸腺苷的反應(yīng)液；其中，所述腺苷酸環(huán)化酶具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，該種腺苷酸環(huán)化酶的穩(wěn)定性好，在中低溫時(shí)的半衰期長(zhǎng)，能夠在中等溫度下高效的一步催化ATP生成cAMP，其對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90％以上，具有工業(yè)簡(jiǎn)單、條件溫和、周期短、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，而且清潔無污染，能夠?qū)崿F(xiàn)cAMP生產(chǎn)過程的節(jié)能、降耗、減排。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物催化領(lǐng)域，具體涉及一種腺苷酸環(huán)化酶制備環(huán)磷酸腺苷的方法。

背景技術(shù)

環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，簡(jiǎn)稱cAMP)是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有重要生理活性的物質(zhì)，其作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，對(duì)糖代謝、脂肪代謝、核酸合成、蛋白質(zhì)合成等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。臨床上cAMP用于治療慢性充血性心力衰竭、肺心病、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；對(duì)改善風(fēng)濕性心臟病的心悸、氣急、胸悶等癥狀有一定的作用；可提高急性白血病結(jié)合化療的療效,亦可用于急性白血病的誘導(dǎo)緩解；此外,對(duì)老年慢性支氣管炎、各種肝炎和銀屑病也有一定療效。cAMP也可作為藥物中間體制備二丁酰環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸腺苷葡甲胺,提高脂溶性，從而發(fā)揮更有效的生理及藥理作用。cAMP亦可用于畜禽飼料添加劑，在離體條件下模擬生長(zhǎng)激素的作用,促進(jìn)畜禽生長(zhǎng),增加優(yōu)質(zhì)禽產(chǎn)品產(chǎn)量。

cAMP的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法三種，目前國(guó)內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全部采用以AMP為原料的化學(xué)合成法。化學(xué)合成法所涉及的試劑昂貴,且采用大量的吡啶作為溶劑，對(duì)人體的皮膚及呼吸道有刺激性,對(duì)人體危害很大,并造成環(huán)境污染,而且合成對(duì)工藝要求很高。生產(chǎn)原料和試劑價(jià)格較高、生產(chǎn)成本偏高。利用液化短桿菌、小桿菌、棒狀桿菌、節(jié)桿菌等以發(fā)酵法制備cAMP也存在限制，如產(chǎn)率較低。

酶法即以腺苷酸環(huán)化酶為酶源或以含有腺苷酸環(huán)化酶的重組菌為催化劑催化生產(chǎn)cAMP，腺苷酸環(huán)化酶(E.C.4.6.1.1)在Mg²⁺參與下，可催化ATP生成cAMP和PPi，是cAMP生物合成的關(guān)鍵酶，但目前對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的高效表達(dá)機(jī)制尚未弄清，離子環(huán)境與細(xì)胞活性的關(guān)系以及調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種腺苷酸環(huán)化酶制備環(huán)磷酸腺苷的方法，該方法能夠有效催化三磷酸腺苷生成環(huán)磷酸腺苷，使用的催化劑腺苷酸環(huán)化酶的穩(wěn)定性好，在中等溫度時(shí)的半衰期長(zhǎng)，在催化過程中表現(xiàn)出良好的催化活性和穩(wěn)定性，對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率高。

為達(dá)到上述目的，技術(shù)方案如下：

一種腺苷酸環(huán)化酶制備環(huán)磷酸腺苷的方法，該方法包括：

以腺苷酸環(huán)化酶為催化劑，以三磷酸腺苷為底物，在Mg²⁺的存在下，獲得含有環(huán)磷酸腺苷的反應(yīng)液；

其中，所述腺苷酸環(huán)化酶具有如A1)、A2)、A3)、A4)、A5)或A6)所示的氨基酸序列：

A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

A2)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

A3)氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；

A4)對(duì)A1)所限定的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替換得到的具有95％以上的同源性的多肽片段或其突變體；

A5)對(duì)A2)所限定的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替換得到的具有95％以上的同源性的多肽片段或其突變體；

A6)對(duì)A3)所限定的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或替換得到的具有95％以上的同源性的多肽片段或其突變體。