[發明專利]多重熒光PCR熔解曲線法檢測幽門螺桿菌耐藥基因多態性的試劑盒

有效

• 申請號: 202011013635.7
• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN111850154B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發明（設計）人: 郜恒駿;孟影;張小燕;沈維祥;陳春峰
• 申請（專利權）人: 上海芯超生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海市匯業律師事務所 31325
• 代理人: 王函

1.一種多重熒光PCR熔解曲線法檢測幽門螺桿菌耐藥基因多態性的試劑盒，其特征在于，所述幽門螺桿菌耐藥基因為以下三個耐藥基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyrA基因；所述耐藥基因突變位點為：克拉霉素2142AG、2142AC、2143AG，四環素926-928AGA，喹諾酮類Asn87-Lys Asp91-Gly/Asn/Tyr；所述試劑盒包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑；所述核酸提取試劑包括超順磁性氧化硅納米磁珠、裂解液、洗滌液、洗脫液；所述核酸擴增試劑包括：與幽門螺桿菌耐藥基因23S rRNA基因對應的引物對和探針、與幽門螺桿菌耐藥基因16S rRNA基因對應的引物對和探針、與幽門螺桿菌耐藥基因gyrA基因對應的引物對和探針、以及與內標基因人類管家基因β-globin對應的引物對和探針；

所述與幽門螺桿菌耐藥基因23S rRNA基因對應的引物對和探針，其上游引物為如SEQID NO.1所示序列，其下游引物為如SEQ ID NO.2所示序列，其探針序列為如SEQ ID NO.3所示序列；

所述與幽門螺桿菌耐藥基因16S rRNA基因對應的引物對和探針，其上游引物為如SEQID NO.4所示序列，其下游引物為如SEQ ID NO.5所示序列，其探針序列為如SEQ ID NO.6所示序列；

所述與幽門螺桿菌耐藥基因gyrA基因對應的引物對和探針，其上游引物為如SEQ IDNO.7所示序列，其下游引物為如SEQ ID NO.8所示序列，其探針序列為如SEQ ID NO.9所示序列。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的5’端和3’端分別連接有熒光報告基團和熒光淬滅基團；其中，熒光報告基團選自FAM、HEX、TET、CY3、Red-X、TAMRA、ROX中的任意兩種；熒光淬滅基團選自Dabcy1、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一種或兩種。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述人類管家基因β-globin的引物對，其序列如下：

上游引物：5’- GTGCACCTGACTCCTGAGGA -3’ ，如SEQ ID NO.10所示序列；

下游引物：5’- CTTGATACCAACCTGCCCAG -3’ ，如SEQ ID NO.11所示序列；

所述人類管家基因β-globin的探針序列如下：

5’- AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG -3’，如SEQ ID NO.12所示序列；探針的5’端標記HEX基團作為熒光基團，3’端使用BHQ1作為淬滅基團。

4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸提取試劑中，裂解液為異硫氰酸胍、鹽酸胍和檸檬酸三鈉中的任意一種或多種；洗滌液為乙醇和/或胍鹽；洗脫液為TE緩沖液。

5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸擴增試劑還包括PCR緩沖溶液和鹽溶液。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖溶液為Tris-HCl；所述鹽溶液為MgSO₄或KCl；按照反應體系25μL計算 ，限制性引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.10所示引物的濃度為0.01-0.1μM，過量引物如：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示引物的濃度為0.1-1μM，探針濃度為0. 1-0.2μM；DNA聚合酶1U/test-5U/test；PCR緩沖溶液包括：Tris-HCl的濃度為0.5mM-2 mM；KCl濃度為0.5mM-2 mM；Mg₂₊濃度為2 mM -5 mM；dNTPs濃度為2 mM -5mM。

7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照品和陰性對照品；陽性對照品中含有所述三個耐藥基因的突變質粒和野生型質粒，陰性對照品為含有人基因組的TE緩沖液。