[發(fā)明專利]多重?zé)晒釶CR熔解曲線法檢測幽門螺桿菌耐藥基因多態(tài)性的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011013635.7
• 申請(qǐng)日: 2020-09-24
• 公開（公告）號(hào): CN111850154B
• 公開（公告）日: 2021-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郜恒駿;孟影;張小燕;沈維祥;陳春峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海芯超生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 上海市匯業(yè)律師事務(wù)所 31325
• 代理人: 王函

本發(fā)明公開了一種多重?zé)晒釶CR熔解曲線法檢測幽門螺桿菌耐藥基因多態(tài)性的試劑盒，幽門螺桿菌耐藥基因?yàn)橐韵?個(gè)基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因；試劑盒包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑；核酸提取試劑包括超順磁性氧化硅納米磁珠、裂解液、洗滌液、洗脫液；核酸擴(kuò)增試劑包括：分別與幽門螺桿菌耐藥基因23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因、內(nèi)標(biāo)基因人類管家基因β?globin對(duì)應(yīng)的引物對(duì)和探針。本發(fā)明可在單管中同時(shí)檢測三個(gè)耐藥位點(diǎn)和1個(gè)內(nèi)標(biāo)基因，提高樣本檢測通量；同時(shí)改善檢測體系中多對(duì)引物探針間的干擾，有效提高試劑檢測的靈敏度和特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多重?zé)晒釶CR熔解曲線法檢測幽門螺桿菌耐藥基因多態(tài)性的試劑盒。本試劑盒用于胃粘膜組織樣本中對(duì)幽門螺桿菌gyrA基因、23S rRNA基因、16S rRNA基因上常見耐藥突變的定性檢測，輔助臨床治療的藥物選擇。

背景技術(shù)

目前對(duì)幽門螺桿菌耐藥的檢測方法包括藥敏檢測、核酸測序、TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR法等。藥敏檢測為幽門螺桿菌耐藥檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法，可以直觀確定幽門螺桿菌對(duì)何種抗生素具有耐藥性；核酸測序法可以借助不同的測序引物對(duì)待測樣本進(jìn)行測序，通過對(duì)耐藥基因核酸序列進(jìn)行比對(duì)，評(píng)估耐藥基因是否發(fā)生突變；TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR法借助熒光檢測平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)分別對(duì)待測物各耐藥基因的檢測，可有效區(qū)分各耐藥基因的突變方向。

現(xiàn)有技術(shù)存在的問題：

目前對(duì)幽門螺桿菌耐藥檢測的方法有多種，臨床上使用較多的是體外藥敏試驗(yàn)，即通過培養(yǎng)幽門螺桿菌與不同種類的抗生素進(jìn)行體外培養(yǎng)從而確定其的最低抑菌濃度，從而判斷是否對(duì)所測試抗生素具有耐藥性。該方法大概可分為肉湯微量稀釋法、紙片擴(kuò)散法、E-test、瓊脂稀釋法等。紙片擴(kuò)散法操作簡單，價(jià)格較為低廉，但是缺乏可用的標(biāo)準(zhǔn)紙片濃度，沒有標(biāo)準(zhǔn)的有效抑制直徑，只能得到定性數(shù)據(jù)；肉湯微量稀釋法操作較為繁瑣，但能夠得到細(xì)菌臨床分離株對(duì)于抗菌藥物的MIC值；瓊脂稀釋法是CLSI規(guī)定的檢測幽門螺桿菌抗菌藥物敏感性的標(biāo)準(zhǔn)方法，能夠快速、準(zhǔn)確得到臨床分離株是否對(duì)某種抗生素具有耐藥性，但是該方法操作繁瑣，技術(shù)要求高，需要花費(fèi)大量時(shí)間，常被用作評(píng)估其他方法的對(duì)照法或進(jìn)行大樣本的研究，不適合運(yùn)用于臨床個(gè)例；E-test法可測定連續(xù)的MIC值，且適合運(yùn)用于幽門螺桿菌這種生產(chǎn)緩慢的細(xì)菌，操作簡單，在臨床標(biāo)本的使用上比較方便，但價(jià)格較高、不易普及推廣。

中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN201610943701公開了一種檢測幽門螺桿菌耐藥突變位點(diǎn)的試劑盒和方法，該專利是利用經(jīng)過blocker修飾的引物對(duì)未發(fā)生突變的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行封閉，然后利用ARMS引物針對(duì)突變的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，通過ARMS引物對(duì)各耐藥位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測。在該檢測過程中存在以下幾方面問題：1、Blocker修飾的引物與擴(kuò)增引物競爭與靶標(biāo)結(jié)合，降低擴(kuò)增引物與靶標(biāo)的結(jié)合效率，導(dǎo)致靈敏度降低；2、ARMS引物檢測原理是依靠個(gè)別堿基差異進(jìn)行型別區(qū)分，因此會(huì)出現(xiàn)由于引物錯(cuò)配引起的假陽性結(jié)果，導(dǎo)致特異性降低；3、該體系中需要針對(duì)不同的突變位點(diǎn)需設(shè)置不同的ARMS引物和blocker引物，試劑成本會(huì)比較高，提高檢測成本，增加病人的檢測費(fèi)用。4、檢測一個(gè)樣本的7個(gè)堿基突變方向，需要1個(gè)樣本檢測8次，以確定堿基是否發(fā)生突變，導(dǎo)致在臨床檢測中操作繁瑣、檢測通量低，檢測費(fèi)用高，不適于臨床使用。