[發(fā)明專利]一種臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基及其制備方法

有效

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• 申請日: 2020-09-24
• 公開（公告）號: CN111925986B
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔興日;吳俊昌;吳玉蘭;王水娣
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市一五零生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 深圳市壹品專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44356
• 代理人: 周婷;江文鑫

本發(fā)明提供一種臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，包括維生素H，轉(zhuǎn)鐵蛋白，血清白蛋白，血小板衍生生長因子，成纖維細胞生長因子，表皮生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子，納米粒子膽固醇，芹菜素以及茉莉酮酸甲酯；可顯著提高間充質(zhì)干細胞的貼壁性能和增殖速率，并有效降低細胞致畸率，還解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的常規(guī)血清或蛋白培養(yǎng)基存在存活率低且代數(shù)品質(zhì)不夠的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于干細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是人體中除造血干細胞以外的另一種成體干細胞，廣泛分布于動物體內(nèi)的骨髓、肝臟和脂肪等多種組織中。其有較好的自我更新能力和多向分化潛能的細胞，同時MSCs還是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞。MSCs在炎癥細胞因子刺激后對免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出很強的抑制作用，可以減少體內(nèi)的免疫排斥，延長移植物的存活時間。因此，間充質(zhì)干細胞在組織工程中的化骨、軟骨，心肌構(gòu)建的種子細胞和在造血干細胞、器官移植中具有廣泛的應用前景。

傳統(tǒng)上，間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法是使用含有動物血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。為了使細胞在體外維持的時間更長，促進細胞增殖，通常選擇在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 1%～20%的小牛血清（用于重組蛋白）或胎牛血清（用于雜交瘤生產(chǎn)單抗）。雖然來源于動物體的血清是復雜的多成分混合物，含有的生長因子、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、激素等可促進細胞生長，刺激產(chǎn)物分泌，并可保護細胞免受環(huán)境 pH、剪切力及蛋白酶等的損傷。但血清的使用在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中存在許多問題：①來源污染問題；②季節(jié)與地域的不同以及動物個體或群體的差異均會造成血清的批間差異；③成分復雜問題；④下游的純化區(qū)分困難。因此，單抗藥物的生產(chǎn)工藝中已不再添加血清作為細胞生長的輔助成分，無血清培養(yǎng)成為哺乳動物細胞規(guī)模化培養(yǎng)的趨勢。

當前，無血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，以滿足干細胞的培養(yǎng)要求，同時避免因使用血清帶來的諸多不利因素。無血清培養(yǎng)基大致可分為以下幾類：①無血清培養(yǎng)基，不含血清，但含有大量的動物或植物蛋白（如 BSA 和動物激素等）和其他一些細胞因子，這類方法仍然不利于目標蛋白的分離純化；②無蛋白培養(yǎng)基，不含有大分子蛋白組分，但可能含有多肽片段（蛋白水解物），生產(chǎn)成本低，此類是目前市售的主要產(chǎn)品；③無動物源性組分培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含動物源性或人源性組分，可能含有細菌或酵母水解物及植物水解物，細胞培養(yǎng)與生產(chǎn)易做到恒定無動物源，使用風險低；④化學界定培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中所有成分均是明確的，不含有動物蛋白與植物水解物，可添加一些結(jié)構(gòu)與功能已知的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，有利于細胞目標產(chǎn)物的分析。

已有研究表明，在培養(yǎng)液中使用表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等生長因子，以及三七總皂甙、丹參酮ⅡA等中藥成分能有效促進干細胞的增殖。與干細胞生物學行為相關(guān)的生長因子主要有血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子。無血清培養(yǎng)基是干細胞走向臨床應用的重要條件，也是近年來的研究熱點之一。

中國專利申請CN201410018678.2公開了一種培養(yǎng)胎盤間充質(zhì)干細胞的無血清培養(yǎng)基，所述無血清培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，還含有成纖維細胞生長因子受體2、生長激素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、谷胱甘肽、BMP-4、L-谷氨酸胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸以及β-巰基乙醇。該無血清培養(yǎng)基可以實現(xiàn)胎盤間充質(zhì)干細胞的貼壁生長，保持細胞的增殖能力。但是，該培養(yǎng)基中的β-巰基乙醇是一種具有強烈刺激性氣味、毒性較高的有機化合物，引入的外延基因以及病毒基因，極易導致致畸提高，并嚴重影響后續(xù)代數(shù)的細胞品質(zhì)，不容易在保證遺傳背景的情形下延長和保證細胞代數(shù)。

中國專利申請CN201310134502.9公開了一種無血清的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在DMEM-LG培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了堿性成纖維生長因子、表皮生長因子、肝素、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、白血病抑制因子和丙酮酸鈉等組分，但未添加促進貼壁的細胞因子，需要使用包被的培養(yǎng)器皿以提高貼壁性能，且未添加白蛋白等營養(yǎng)成分，增殖較緩慢等問題。