[發明專利]鑒別柿樹性別的分子標記引物及鑒別方法

在審

• 申請號: 202011009331.3
• 申請日: 2020-09-23
• 公開（公告）號: CN112029893A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 王麗媛;傅建敏;孫鵬;張嘉嘉;索玉靜;韓衛娟;刁松鋒;李華威
• 申請（專利權）人: 國家林業和草原局泡桐研究開發中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

本發明公開鑒別柿樹性別的分子標記引物及鑒別方法，包括正向引物和反向引物，為序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。鑒別方法為：提取柿樹葉片DNA；利用分子標記引物對所提取的DNA進行PCR擴增；PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行分離并拍照；根據電泳圖中的條帶情況對柿樹進行性別鑒定。可以在育苗階段將開雄花的種苗分離出來，無需等到5?8年柿樹開花后再剔除雜交個體中的雄性種質，能夠在育苗階段對柿雜交子代的性別進行早期鑒定，盡早淘汰雄株，篩選出具有優良性狀雜交子代雌株，提高柿雜交子代的早期選擇效率，降低育種成本，有利于雜交育種工作的順利開展，推動育種和產業發展，及推動柿產業的順利發展。

技術領域

本發明涉及分子鑒別技術領域。具體地說是鑒別柿樹性別的分子標記引物及鑒別方法。

背景技術

柿(Diospyros kaki Thunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，是原產我國的、重要的木本糧食樹種。柿果實營養豐富，可溶性固形物和單寧含量高，葉片富含Vc、黃酮、多酚等活性成分，在食品、保健、化工和醫藥等領域的開發價值和應用潛力越來越受到重視，對柿育種和栽培技術的研究可為精準扶貧、農業綜合體建設及國家糧食安全等方面提供強有力的科技支撐。

值得注意的是，柿栽培品種絕大部分為完全雌株(只開雌花)和雌雄同株(雌花和雄花同株)，柿野生資源中存有完全雄株(只開雄花)。此外，柿從種子播種到實生苗首次開花結果通常需要5-8年的時間。柿童期長的特點嚴重限制了具有優良性狀雜交子代雌株的早期篩選的同時，在育苗及種植管理過程中也花費了大量的人力、物力和財力，降低了柿良種培育的工作效率。因此，有必要開發高效穩定的性別分子標記，在育苗階段對柿種苗性別進行早期鑒定，對于加速育種進程及育苗成本控制具有重要意義。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于提供一種鑒別柿樹性別的分子標記引物及鑒別方法，利用分子標記引物在育苗階段對柿樹的性別進行早期鑒定，對于提高柿雜交子代雌株的早期選擇效率及降低雜種圃的管理成本具有重要意義。

為解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案：

鑒別柿樹性別的分子標記引物，包括正向引物和反向引物，其序列分別為序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。

鑒別柿樹性別的方法，包括如下步驟：

(1)提取柿樹葉片DNA；

(2)利用權利要求1所述的正向引物和反向引物對所提取的DNA進行PCR擴增；

(3)PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行分離并拍照；

(4)根據電泳圖中的條帶情況對柿樹進行性別鑒定。

上述鑒別柿樹性別的方法，在步驟(1)中：

(1-1)用電子天平迅速稱取約0.5g的柿樹幼嫩葉片于研缽中，利用液氮將樣品充分研磨成粉末后，快速轉入盛有預熱至65℃的800μL 2×溴化十六烷基三甲銨CTAB緩沖液的2ml離心管中，65℃水浴提取30min；

(1-2)加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿和異戊醇體積比為24：1，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min，將上清液轉入新的離心管，再次加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min；取上清液于新的離心管后，加入2倍體積且預冷至-20℃的乙醇，緩慢搖勻至DNA絮狀沉淀析出；

(1-3)10000rpm離心10min，倒去上清液；用體積分數為70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；室溫放置5min使沉淀物自然風干后，加入預熱至65℃的50μL的ddH₂O，即得到柿基因組DNA；