[發(fā)明專利]鑒別柿樹性別的分子標(biāo)記引物及鑒別方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011009331.3
• 申請日: 2020-09-23
• 公開（公告）號(hào): CN112029893A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王麗媛;傅建敏;孫鵬;張嘉嘉;索玉靜;韓衛(wèi)娟;刁松鋒;李華威
• 申請（專利權(quán)）人: 國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.鑒別柿樹性別的分子標(biāo)記引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其序列分別為序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。

2.鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取柿樹葉片DNA；

(2)利用權(quán)利要求1所述的正向引物和反向引物對所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并拍照；

(4)根據(jù)電泳圖中的條帶情況對柿樹進(jìn)行性別鑒定。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(1)中：

(1-1)用電子天平迅速稱取約0.5g的柿樹幼嫩葉片于研缽中，利用液氮將樣品充分研磨成粉末后，快速轉(zhuǎn)入盛有預(yù)熱至65℃的800μL 2×溴化十六烷基三甲銨CTAB緩沖液的2ml離心管中，65℃水浴提取30min；

(1-2)加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿和異戊醇體積比為24：1，渦旋混勻后在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，再次加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，渦旋混勻后在12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min；取上清液于新的離心管后，加入2倍體積且預(yù)冷至-20℃的乙醇，緩慢搖勻至DNA絮狀沉淀析出；

(1-3)10000rpm離心10min，倒去上清液；用體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；室溫放置5min使沉淀物自然風(fēng)干后，加入預(yù)熱至65℃的50μL的ddH₂O，即得到柿基因組DNA；

(1-4)利用1.0％瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計(jì)法檢測DNA樣品的純度和濃度，樣品檢測合格后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，重復(fù)循環(huán)30次；72℃延伸5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴(kuò)增的體系為：Taq DNA聚合酶12.5μL；10μM上游引物1μL；10μM下游引物1μL；模板DNA 1μL；加入ddH₂O補(bǔ)齊到25μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(3)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0wt％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳條件為150V、400mA，電泳時(shí)間為20min。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，電泳凝膠上268bp處顯示1條條帶的為開雄花的完全雄株或雌雄同株，無條帶的為不開雄花的完全雌株。