[發明專利]鑒別柿樹性別的分子標記引物及鑒別方法

在審

• 申請號: 202011009331.3
• 申請日: 2020-09-23
• 公開（公告）號: CN112029893A
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 王麗媛;傅建敏;孫鵬;張嘉嘉;索玉靜;韓衛娟;刁松鋒;李華威
• 申請（專利權）人: 國家林業和草原局泡桐研究開發中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6879;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京冠榆知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11666
• 代理人: 朱亞琦

1.鑒別柿樹性別的分子標記引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其序列分別為序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。

2.鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取柿樹葉片DNA；

(2)利用權利要求1所述的正向引物和反向引物對所提取的DNA進行PCR擴增；

(3)PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行分離并拍照；

(4)根據電泳圖中的條帶情況對柿樹進行性別鑒定。

3.根據權利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(1)中：

(1-1)用電子天平迅速稱取約0.5g的柿樹幼嫩葉片于研缽中，利用液氮將樣品充分研磨成粉末后，快速轉入盛有預熱至65℃的800μL 2×溴化十六烷基三甲銨CTAB緩沖液的2ml離心管中，65℃水浴提取30min；

(1-2)加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，其中氯仿和異戊醇體積比為24：1，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min，將上清液轉入新的離心管，再次加入等體積的氯仿和異戊醇混合液，渦旋混勻后在12000rpm的轉速下離心10min；取上清液于新的離心管后，加入2倍體積且預冷至-20℃的乙醇，緩慢搖勻至DNA絮狀沉淀析出；

(1-3)10000rpm離心10min，倒去上清液；用體積分數為70％的乙醇清洗沉淀物2-3次；室溫放置5min使沉淀物自然風干后，加入預熱至65℃的50μL的ddH₂O，即得到柿基因組DNA；

(1-4)利用1.0％瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計法檢測DNA樣品的純度和濃度，樣品檢測合格后置于-20℃冰箱保存備用。

4.根據權利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴增的程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，重復循環30次；72℃延伸5min。

5.根據權利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(2)中，PCR擴增的體系為：Taq DNA聚合酶12.5μL；10μM上游引物1μL；10μM下游引物1μL；模板DNA 1μL；加入ddH₂O補齊到25μL。

6.根據權利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，在步驟(3)中，PCR擴增產物用1.0wt％的瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳條件為150V、400mA，電泳時間為20min。

7.根據權利要求2所述的鑒別柿樹性別的方法，其特征在于，電泳凝膠上268bp處顯示1條條帶的為開雄花的完全雄株或雌雄同株，無條帶的為不開雄花的完全雌株。